ПЦР Гарднерелла вагиналис

 

ДНК Gardnerella vaginalis (гарднерелла вагиналис) методом ПЦР (качественное определение)

 

Краткая История

Gardnerella vaginalis была впервые описана в 1955 году американскими исследователями Германом Гарднером и Чарльзом Дюксом, которые выделили бактерию из влагалищных выделений женщин с бактериальным вагинозом (БВ) и первоначально назвали её Haemophilus vaginalis . Долгое время G. vaginalis считалась единственной причиной бактериального вагиноза. Однако в 1980-1990-х годах с развитием молекулярно-биологических методов (ПЦР, секвенирование 16S рРНК) было установлено, что бактериальный вагиноз — это полимикробный синдром, в котором участвуют не только G. vaginalis, но и другие облигатные анаэробы: Atopobium vaginae, Megasphaera spp., BVAB1, BVAB2, Prevotella spp., Mobiluncus spp. и другие . В 2000-х годах были разработаны и внедрены в клиническую практику коммерческие тест-системы для диагностики бактериального вагиноза методом ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR), позволяющие не только выявлять ДНК G. vaginalis, но и оценивать её количественное соотношение с лактобациллами (нормальной микрофлорой влагалища) . Сегодня определение ДНК Gardnerella vaginalis методом ПЦР является высокочувствительным и специфичным методом лабораторной диагностики бактериального вагиноза, особенно в случаях бессимптомного течения, стертой клинической картины и рецидивирующих форм.

 

Материал, используемый для исследования

• • Тип образца:Урогенитальный соскоб (эпителиальные клетки слизистых оболочек урогенитального тракта).
  • Локализация забора материала (в зависимости от пола и клинических проявлений):

• У женщин:Соскоб из заднего свода влагалища, из цервикального канала, из уретры (реже) .
• У мужчин:Соскоб из уретры (на глубину 2-4 см), первая порция утренней мочи (при трудностях с взятием соскоба), секрет предстательной железы, эякулят .
  • Тип пробирки/системы сбора:Специальная пробирка с транспортной средой для ПЦР (содержит консервант, предотвращающий деградацию ДНК и рост бактерий). Используются коммерческие системы: «Инцит-тампон» (Incyte Swab), пробирки с транспортной средой для ПЦР (например, «ДНК-сорб», «АмплиСенс», «Эппендорф») . Важно: Обычные мазки на стекле для ПЦР не пригодны (необходим транспорт для сохранения ДНК).
  • Объем материала:Достаточное количество эпителиальных клеток (визуально – соскоб должен содержать видимый биоматериал). Недостаточное количество клеток – причина ложноотрицательных результатов.
  • Обработка:После взятия материала тампон/зонд тщательно споласкивается в транспортной среде (несколько вращательных движений), затем отжимается о стенки пробирки и удаляется. Пробирка плотно закрывается и маркируется (ФИО пациента, дата, время взятия). Доставка в лабораторию осуществляется в день взятия (или в течение 12 часов при хранении при +2…+8°C). Замораживание не допускается. Стабильность ДНК в транспортной среде при комнатной температуре – до 21 дня (в зависимости от системы сбора), при +2…+8°C – до 24-48 часов .

 

Как подготовиться к анализу

Подготовка к анализу критически важна для получения достоверного результата (исключение контаминации, ложноотрицательных и ложноположительных результатов):

 

Женщины:

• Исследование рекомендуется проводить до менструации или через 2-5 дней после её окончания.
• За 3 днядо взятия материала исключить: половые контакты, вагинальные спринцевания, использование вагинальных свечей, таблеток, кремов, гелей, тампонов .
• За 3-5 днейдо взятия материала прекратить использование антибактериальных препаратов местно (вагинально) и системно (внутрь, инъекционно) – после консультации с врачом (нельзя отменять жизненно важные препараты!) .
• В день взятия материала не проводить гигиенические процедуры с использованием антисептиков для подмывания (только чистая вода).

 

Мужчины:

• За 3 днядо взятия материала исключить половые контакты.
• За 3-5 днейдо взятия материала прекратить прием антибактериальных препаратов (после консультации с врачом).
• Перед взятием соскоба из уретры не мочиться в течение 3 часов.
• Накануне и в день взятия материала не использовать антисептики для туалета половых органов.

 

Общие требования:

• За 2-3 неделидо исследования исключить прием антибиотиков (системно) – по согласованию с врачом. Если пациент принимает антибиотики по поводу другого заболевания, исследование следует отложить до окончания курса.
• Сообщить врачу о наличии острых инфекционных заболеваний (лихорадка, ОРВИ, ангина) – анализ следует отложить на 2-4 недели после выздоровления.
• Исключить употребление алкоголя за 24 часа до исследования.
• В день взятия материала не курить за 1-2 часа (по возможности).

 

Описание данного вещества (Gardnerella vaginalis и метод ПЦР)

Gardnerella vaginalis – это грамвариабельная (грамположительная или грамотрицательная в зависимости от стадии роста), факультативно-анаэробная, неподвижная, палочковидная бактерия, не образующая спор . Она является частью нормальной микрофлоры влагалища у здоровых женщин, но в небольших количествах (до 10^3-10^4 КОЕ/мл). При нарушении микробиоценоза влагалища (снижении количества лактобацилл, повышении pH > 4,5) G. vaginalis начинает активно размножаться, становясь доминирующим микроорганизмом, и является одной из основных причин бактериального вагиноза (БВ) .

 

Роль G. vaginalis в бактериальном вагинозе:

• Вытесняет нормальную микрофлору (лактобациллы), продуцирующие перекись водорода и молочную кислоту.
• Повышает pH влагалища (создает благоприятную среду для других анаэробов – Atopobium vaginae, Prevotella, Mobiluncus, BVAB2 и др.).
• Продуцирует ферменты (сиалидазу, муциназу), разрушающие защитный слизистый барьер.
• Выделяет летучие амины (путресцин, кадаверин, триметиламин), которые придают характерный «рыбный» запах влагалищным выделениям .

Важно: Бактериальный вагиноз – это полимикробный синдром. Обнаружение только G. vaginalis без других анаэробов может быть вариантом нормы (бессимптомное носительство) . Для клинически значимого БВ характерно наличие G. vaginalis в сочетании с Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera и снижением количества лактобацилл .

 

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция):

• Качественная ПЦР:Определяет наличие (обнаружено/не обнаружено) ДНК G. vaginalis в образце. Не позволяет оценить количество бактерий. Чувствительность метода – 10-100 копий ДНК в пробе (или 1 нг ДНК) .
• Количественная ПЦР (Real-Time PCR):Позволяет не только обнаружить ДНК G. vaginalis, но и определить её количество (КОЕ/мл или геном-эквивалент/мл), а также соотношение G. vaginalis / лактобациллы. Это более информативно для диагностики клинически значимого БВ. Например, коммерческая тест-система ATRiDA (мультиплексная ПЦР) оценивает соотношение G. vaginalis и Atopobium vaginae к общей бактериальной нагрузке и лактобациллам .
• Специфичность:Высокая (95-100%). Современные праймеры специфичны к ДНК G. vaginalis и не перекрестно реагируют с другими микроорганизмами (лактобациллы, кишечная палочка, стафилококки) .
• Чувствительность:Очень высокая (90-100%). ПЦР может выявлять G. vaginalis даже при очень низкой концентрации (например, при бессимптомном носительстве) .

 

Диагностика заболеваний

Качественное (и количественное) определение ДНК G. vaginalis используется для:

1. Диагностики бактериального вагиноза (БВ) у женщин:Это основное показание. Особенно когда клиническая картина неясна (стертые симптомы, отсутствие характерного «рыбного» запаха), при рецидивирующих формах БВ, при бессимптомном течении (скрининг беременных, обследование перед внутриматочными процедурами) . ПЦР имеет более высокую чувствительность, чем классические методы (критерии Амселя, микроскопия мазка по Ньюдженту) .
2. Дифференциальной диагностики вагинальных инфекций:Отличить бактериальный вагиноз от кандидозного вульвовагинита (молочницы), трихомониаза, аэробного вагинита. Часто используется мультиплексная ПЦР (одновременное выявление G. vaginalis, Atopobium vaginae, Candida spp., Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae) .
3. Обследования пациенток с патологическими выделениями из влагалища (бели, сероватые/белые выделения с «рыбным» запахом, зуд, жжение, дискомфорт при половом акте).
4. Обследования беременных (скрининг):Бактериальный вагиноз, вызванный G. vaginalis и другими анаэробами, ассоциирован с повышенным риском преждевременных родов, преждевременного разрыва плодных оболочек, хориоамнионита (воспаления плодных оболочек), послеродового эндометрита, рождения детей с низкой массой тела . Выявление G. vaginalis (особенно в высоком титре) у беременных требует лечения (во II и III триместрах) для снижения риска осложнений.
5. Обследования перед гинекологическими операциями и манипуляциями:Перед абортом, гистероскопией, установкой внутриматочной спирали (ВМС), биопсией эндометрия. Бактериальный вагиноз повышает риск восходящей инфекции и воспалительных осложнений .
6. Обследования пациенток с рецидивирующим бактериальным вагинозом:Для выяснения причины рецидивов (персистенция G. vaginalis, устойчивость к метронидазолу, наличие других анаэробов, неэффективность лечения полового партнера). У некоторых штаммов G. vaginalis выявляется устойчивость к метронидазолу, клиндамицину, ампициллину .
7. Обследования мужчин (реже):При наличии симптомов уретрита (жжение, резь при мочеиспускании, выделения из уретры), простатита, эпидидимита неясной этиологии. G. vaginalis может вызывать эти заболевания у мужчин, но значительно реже, чем у женщин . Чаще у мужчин – бессимптомное носительство (транзиторное, до 2-3 дней) .

 

Цель исследования

Основные цели качественного (и количественного) определения ДНК Gardnerella vaginalis:

1. Лабораторное подтверждение бактериального вагиноза (БВ)у женщин с клиническими проявлениями (патологические выделения, зуд, неприятный запах).
2. Скрининг бактериального вагинозау беременных (для профилактики преждевременных родов и других осложнений), перед гинекологическими операциями и манипуляциями, у пациенток с рецидивирующими воспалительными заболеваниями органов малого таза.
3. Дифференциальная диагностикавагинальных инфекций (БВ vs кандидоз vs трихомониаз vs аэробный вагинит) – в составе мультиплексной ПЦР.
4. Обследование пациенток с рецидивирующим БВ(после неоднократных курсов лечения) – для выявления персистенции G. vaginalis, оценки антибиотикорезистентности (по возможности), подбора рациональной терапии.
5. Обследование половых партнеров(мужчин) при рецидивирующем БВ у женщины (хотя эффективность лечения половых партнеров остается спорной, но в некоторых случаях рекомендуется).
6. Оценка эффективности лечения(в динамике, через 4-6 недель после окончания курса терапии). Цель – отрицательный результат ПЦР (или снижение количества G. vaginalis до нормальных значений – < 10^3-10^4 КОЕ/мл при количественном исследовании).

 

Что значат полученные результаты

Интерпретация результатов качественного определения ДНК G. vaginalis всегда проводится врачом-гинекологом, урологом, дерматовенерологом в контексте клинической картины (наличие симптомов), данных осмотра (pH влагалища, наличие «рыбного» запаха при добавлении KOH, «ключевые клетки» при микроскопии), а также с учетом результатов других тестов (общий мазок, выявление других возбудителей – Candida, Trichomonas, Chlamydia, Mycoplasma). Референсное значение – «не обнаружено» (для качественной ПЦР) .

 

Референсные значения (качественная ПЦР):

• Отрицательный результат («не обнаружено»):ДНК Gardnerella vaginalis в исследуемом образце не обнаружена (или концентрация ниже предела чувствительности метода, обычно < 10^2-10^3 КОЕ/мл). Бактериальный вагиноз маловероятен. Однако при отрицательном результате, но наличии типичных клинических симптомов (выделения с рыбным запахом, зуд), необходимо исключить другие причины (аэробный вагинит, десквамативный воспалительный вагинит, атрофический вагинит) или провести количественное ПЦР-исследование (возможно, концентрация G. vaginalis низкая, но другие анаэробы – Atopobium, Prevotella, BVAB2 – могут быть причиной БВ) .
• Положительный результат («обнаружено»):ДНК Gardnerella vaginalis обнаружена в исследуемом образце. Указывает на наличие G. vaginalis в урогенитальном тракте. Однако НЕ ВСЕГДА означает бактериальный вагиноз! vaginalis может присутствовать в норме у 30-50% здоровых женщин (бессимптомное носительство) . Клиническое значение зависит от:

• Количества G. vaginalis(при качественной ПЦР не оценивается – требуется количественный тест).
• Наличия других анаэробов(Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera, Prevotella) – при БВ обычно есть сочетание.
• Соотношения G. vaginalis / лактобациллы(при количественной ПЦР).
• Клинических симптомов(выделения, зуд, запах) и pH влагалища (> 4,5).

 

Интерпретация в зависимости от клинической ситуации:

• Положительный результат + наличие симптомов (выделения с «рыбным» запахом, зуд/жжение, pH > 4,5, «ключевые клетки» в мазке):

• Интерпретация:Бактериальный вагиноз. Требует лечения (метронидазол, клиндамицин – перорально или вагинально) . При рецидивирующем течении – длительные курсы, лечение полового партнера (спорно), поддержание лактобациллярной флоры (пробиотики).
  • Положительный результат + отсутствие симптомов (случайная находка при скрининге):
• Интерпретация:Бессимптомное носительство G. vaginalis (вариант нормы). Лечение обычно не требуется (за исключением беременных и перед гинекологическими операциями/манипуляциями). У беременных – решение о лечении принимает врач (риск преждевременных родов) .
  • Отрицательный результат + наличие симптомов (выделения, зуд):
• Интерпретация:Бактериальный вагиноз маловероятен. Следует исключать другие причины:
  • Кандидоз (Candida spp.) – творожистые выделения, зуд.
  • Трихомониаз (Trichomonas vaginalis) – пенистые выделения, зуд, гиперемия, «земляничный» вид шейки матки.
  • Аэробный вагинит (Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, E. coli) – гнойные выделения, воспаление.
  • Десквамативный воспалительный вагинит.
  • Атрофический вагинит (у женщин в постменопаузе).
• Рекомендуется мультиплексная ПЦР (на Candida, Trichomonas, Chlamydia, Mycoplasma) и микробиологическое исследование (посев).
  • Количественная ПЦР (соотношение G. vaginalis / лактобациллы):
• Соотношение > 1 (G. vaginalis преобладает над лактобациллами):Высокая вероятность БВ (особенно в сочетании с симптомами) .
• Соотношение < 1 (лактобациллы преобладают над G. vaginalis):Норма или бессимптомное носительство. Клинически значимый БВ маловероятен.
• Мультиплексная ПЦР (ATRiDA и аналоги):Оценка нагрузки G. vaginalis и Atopobium vaginae. Высокая нагрузка обоих (более 10^5-10^6 КОЕ/мл) – высокая вероятность БВ. Чувствительность 96,9%, специфичность 70,2% (положительный результат может быть при асимптомном дисбиозе) .

 

Важные нюансы интерпретации:

• Ложноположительный результат:Возможен при контаминации образца (несоблюдение правил асептики, загрязнение реагентов), при низком пороге детекции (обнаружение минимальных количеств ДНК, не имеющих клинического значения – бессимптомное носительство) .
• Ложноотрицательный результат:Возможен при неправильном взятии материала (недостаточное количество эпителиальных клеток), при длительном хранении образца (деградация ДНК), при подавлении ПЦР (ингибиторы в образце), при очень низкой концентрации G. vaginalis (ниже предела чувствительности), при приеме антибиотиков до анализа .
• Бактериальный вагиноз – полимикробный синдром:Обнаружение только G. vaginalis (без Atopobium vaginae, BVAB2, Prevotella) не является достаточным для диагноза БВ. Наиболее точная диагностика – мультиплексная ПЦР на 3-5 анаэробов + лактобациллы .
• Лечение половых партнеров:Эффективность лечения половых партнеров (мужчин) для предотвращения рецидивов БВ у женщин остается спорной. В большинстве рекомендаций лечение партнера не требуется (за исключением рецидивирующих форм, по решению врача) .
• Антибиотикорезистентность G. vaginalis:Некоторые штаммы G. vaginalis устойчивы к метронидазолу (40-50% и более) и другим антибиотикам (ампициллин, тетрациклин) . При рецидивах после лечения метронидазолом рекомендуется провести тест на антибиотикочувствительность (если лаборатория это выполняет) или использовать альтернативные препараты (клиндамицин, тинидазол).

 

Факторы, влияющие на результат

На результат качественного определения ДНК G. vaginalis могут влиять различные преаналитические, аналитические и биологические факторы:

• Преаналитические (до взятия материала):

• Прием антибиотиковза 2-3 недели до анализа – приводит к ложноотрицательным результатам (подавление роста/разрушение ДНК) .
• Использование вагинальных свечей, кремов, спринцеванийза 3-5 дней до анализа – может смывать эпителиальные клетки и удалять ДНК возбудителя (ложноотрицательный результат) .
• Половой акт за 3 дня до анализа– может временно изменять микробиоту влагалища .
• Менструация– кровь содержит ингибиторы ПЦР, может вызывать ложноположительные (контаминация) или ложноотрицательные результаты. Анализ сдают после окончания менструации .
• Недостаточное количество эпителиальных клетокв соскобе – основная причина ложноотрицательных результатов (G. vaginalis ассоциирована с эпителием) .
• Несоблюдение правил асептикипри взятии материала – контаминация образца посторонней ДНК (ложноположительный результат) .

 

Аналитические (на этапе лабораторного исследования):

• Контаминация реагентов и лабораторной посудыампликонами (продуктами ПЦР) – ложноположительный результат. Современные лаборатории используют системы с УФ-деконтаминацией и раздельные зоны для выделения ДНК и амплификации .
• Ингибиторы ПЦРв образце (кровь, слизь, препараты для местного лечения) – ложноотрицательный результат .
• Нарушение температурного режима хранения транспортной среды(замораживание, перегрев) – деградация ДНК (ложноотрицательный результат) .
• Чувствительность тест-системы:Разные коммерческие наборы имеют разную чувствительность (10-100 копий ДНК). Высокочувствительные тесты (например, вложенная ПЦР – nested PCR) могут выявлять очень низкие концентрации G. vaginalis, что может приводить к гипердиагностике (обнаружение бессимптомного носительства) .
• Нарушение калибровки ПЦР-анализатора:Неправильная калибровка флуоресцентного детектора (для Real-Time PCR) – искажение результатов .

 

Биологические факторы:

• Бессимптомное носительство G. vaginalis– самый частый фактор ложноположительных результатов (в интерпретации – положительный ПЦР, но нет клиники). Встречается у 30-50% здоровых женщин .
• Беременность– может влиять на состав микрофлоры влагалища (повышение риска БВ, но также и бессимптомного носительства).
• Гормональный фон– у женщин в постменопаузе (низкий эстрадиол) снижается количество лактобацилл, повышается pH, увеличивается риск БВ и бессимптомного носительства G. vaginalis.
• Наличие других инфекций (Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma)– могут изменять микробиоту влагалища и влиять на колонизацию G. vaginalis.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

---

Список литературы:

1. 高剑云,陈建忠,周坚红.采用套式PCR检测细菌性阴道病病原体加德纳菌及细菌耐药性测定[J].中国卫生检验杂志.2010,20(05):1124-1126.
2. Speksnijder A., Gruteke P., Jonker D. et al. Improved diagnostics of bacterial vaginosis with molecular techniques. Sexually Transmitted Infections. 2011;87(Suppl 1):A81.
3. Incyte Diagnostics. Gardnerella vaginalis Test Directory.
4. 阴道加德纳菌PCR检测试剂盒. 杭州博日科技. 2024.
5. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Бактериальный вагиноз». 2021.
6. van der Veer C., van Houdt R., van Dam A. et al. Accuracy of a commercial multiplex PCR for the diagnosis of bacterial vaginosis. Journal of Medical Microbiology. 2018;67(9):1265-1270.
7. Synevo Laboratory. PCR. Gardnerella vaginalis (u/g scraping, qualitative determination).
8. OHSU Lab Services. Vaginal Pathogens DNA Probe.
9. Verstraelen H., Verhelst R. et al. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints? Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 2006.
10. Медицинская лаборатория НАКФФ. Gardnerella vaginalis, качественное определение ДНК. 2021.