ВПЧ высокий риск (ПЦР) (количественный)

Краткая История
Качественное обнаружение ВКР ВПЧ стало прорывом в скрининге РШМ. Однако стало ясно, что вирусная нагрузка(количество копий ДНК вируса на клетку) является важным независимым фактором риска персистенции инфекции и прогрессирования в дисплазию (CIN) и рак. Развитие ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)в конце 1990-х — начале 2000-х годов позволило не только детектировать ДНК ВКР ВПЧ, но и количественно определять ее количество в образце. Первые количественные тесты часто определяли общую нагрузку группы ВКР типов. Современные тесты, такие как количественные версии «ВПЧ КВАНТ», позволяют определять как общую нагрузку ВКР ВПЧ, так и нагрузку отдельных типов (особенно 16 и 18). Это дало мощный инструмент для стратификации риска и индивидуального подхода к ведению пациентов.
Материал, используемый для исследования

Основной материал: Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала (у женщин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из уретры (у мужчин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из вульвы/вагины/перианальной области ИЛИ биоптат/мазок-отпечаток с очага.
Тип контейнера: Специальная стерильная щеточка (цитощетка) в жидкой транспортной среде (ThinPrep® или аналоги). Обязательно! Для корректного количественного определения необходим учет количества клеток эпителия.
Важно: Использовать специализированные наборы для забора, обеспечивающие сохранность клеток и ДНК.

Как подготовиться к анализу
Подготовка идентичнаподготовке к качественному тесту и тестам «КВАНТ» (см. статьи 2-4):

Женщины: Не во время менструации. За 48 часов: исключить секс, вагинальные препараты, тампоны, спринцевания, УЗИ, кольпоскопию. За 24 часа: не использовать антисептики.
Мужчины/Женщины (уретра): За 48 часов исключить секс. За 1.5-2 часа не мочиться перед соскобом из уретры.
Общее: Не применять местные антисептики/антибиотики за 48-72 часа. Отмена системных противовирусных – по согласованию. После кольпоскопии – 48-72 часа. После лечения – минимум 4-6 недель.
Транспортировка: +2…+8°С, в течение 1-3 дней. Нарушение условий критично для количественного результата.

Описание метода

Метод: Количественная Полимеразная Цепная Реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Принцип:
1. Экстракция ДНК: Выделение ДНК из образца.
2. Амплификация в реальном времени: Копирование специфического участка ДНК ВКР ВПЧ в присутствии флуоресцентного репортера (интеркалирующий краситель SYBR Green или специфический флуоресцентный зонд — TaqMan, Hybrid Probe). Интенсивность флуоресценции растет пропорционально количеству накопленного продукта ПЦР.
3. Калибровка: Для каждого цикла амплификации (Ct — пороговый цикл) регистрируется уровень флуоресценции. Чем раньше (ниже значение Ct) появляется значимый сигнал флуоресценции, перекрывающий пороговый уровень, тем больше было целевой ДНК в исходном образце.
4. Количественное определение:
  - Стандартная кривая: Использование образцов с известной концентрацией ДНК ВПЧ для построения графика зависимости Ct от логарифма концентрации. По этому графику рассчитывается концентрация ДНК в клиническом образце.
  - Относительное количество: Чаще используется в клинических тестах. Нагрузка рассчитывается относительно количества клеток человека в образце (по гену-референсу, например, β-глобин, RNase P — Контроль Взятия Материала, КВМ). Результат выдается в Геномных Эквивалентах (ГЭ) на 10^5 клеток эпителия.
5. Определение группы/типов: Используются:
  - Консенсусные праймеры/зонды: Определяют общую нагрузку группы ВКР ВПЧ (без дифференциации типов).
  - Типоспецифичные праймеры/зонды: Позволяют определить нагрузку конкретных типов (чаще всего 16 и 18 отдельно, а остальные ВКР типы — суммарно или также отдельно). Конкретная панель зависит от тест-системы (аналогично «КВАНТ-15» или «КВАНТ-4», но с количественным результатом для каждого).

Диагностика заболеваний
Количественный тест на ВКР ВПЧ используется для:

Скрининга РШМ: Стратификация риска не только по наличию, но и по уровню вирусной нагрузки.
Триажирования аномальных результатов цитологии (ASC-US): Высокая нагрузка ВКР ВПЧ повышает вероятность CIN.
Оценки риска персистенции ВПЧ и прогрессирования в CIN/рак: Высокая исходная нагрузка и/или ее увеличение в динамике — неблагоприятные прогностические факторы.
Мониторинга течения ВПЧ-инфекции: Наблюдение за изменением вирусной нагрузки в динамике (спонтанное снижение/исчезновение — признак транзиторной инфекции; персистенция или рост — признак высокого риска).
Контроля эффективности лечения CIN (дисплазии): Снижение нагрузки или элиминация вируса — хороший прогностический признак. Персистенция высокой нагрузки — риск рецидива.

Цель исследования
Основные цели назначения:

Количественная оценка вирусной нагрузки ВКР ВПЧ: Определение не только факта инфицирования, но и количества вирусной ДНК.
Стратификация индивидуального риска развития CIN/РШМ: Высокая нагрузка ВКР ВПЧ (особенно типов 16/18) ассоциирована с повышенным риском наличия и прогрессирования дисплазии.
Дифференциация клинически значимой инфекции от транзиторного носительства: Высокая нагрузка чаще указывает на активную инфекцию с риском персистенции.
Мониторинг естественного течения ВПЧ-инфекции: Оценка спонтанной элиминации (снижение нагрузки до неопределяемого уровня) или персистенции (стабильно высокая или растущая нагрузка).
Оценка эффективности лечения предраковых поражений шейки матки (CIN): Контрольное определение нагрузки после конизации/деструкции для оценки успешности (цель — снижение/исчезновение).

Что значат полученные результаты

Контроль взятия материала (КВМ): Обязательно должен быть ≥ 10^4 клеток (или другого порога, указанного лабораторией). Низкий КВМ делает количественный результат ненадежным.
ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска:
- Не обнаружено: ДНК ВКР ВПЧ (типов, определяемых тестом) не выявлено. Вирусная нагрузка = 0 ГЭ/10^5 клеток.
- Обнаружено (с указанием вирусной нагрузки):
  - Общая нагрузка группы ВКР ВПЧ (если тест не дифференцирует типы) или Нагрузка конкретных типов (16, 18, другие или суммарно).
  - Вирусная нагрузка: Указывается в Логарифмах Геномных Эквивалентов (lg ГЭ) на 10^5 клеток или в абсолютных числах (ГЭ/10^5 клеток). Например:
    - 3.0 x 10^3 ГЭ/10^5 клеток = 3.5 lg ГЭ/10^5 клеток
    - 5.2 x 10^5 ГЭ/10^5 клеток = 5.7 lg ГЭ/10^5 клеток
  - Клиническая интерпретация нагрузки (ориентировочно):
    - < 10^3 ГЭ/10^5 клеток (< 3.0 lg): Низкая нагрузка. Чаще соответствует транзиторной инфекции или носительству. Риск CIN2+ низкий, но не нулевой.
    - 10^3 – 10^5 ГЭ/10^5 клеток (3.0 – 5.0 lg): Умеренная нагрузка. Требует внимания. Риск наличия CIN1-2.
    - 10^5 ГЭ/10^5 клеток (> 5.0 lg): Высокая нагрузка. Ассоциирована с повышенным риском наличия CIN2+ (умеренной/тяжелой дисплазии или рака in situ) и персистенции вируса. Требует обязательного углубленного обследования (кольпоскопия).
  - Особое значение имеет нагрузка ВПЧ 16 и 18 типа: Даже умеренная нагрузка этих типов требует повышенного внимания из-за их исключительно высокой онкогенности. Высокая нагрузка 16/18 — сильный показатель риска CIN2+.
Важно:
- Результат всегда интерпретирует врач в комплексе с цитологией, кольпоскопией, анамнезом, возрастом.
- Высокая нагрузка — не диагноз рака, а индикатор высокого риска, требующий дообследования.
- Низкая нагрузка не исключает полностью наличие дисплазии (особенно на ранних стадиях).
- Отрицательный результат (не обнаружено) — хороший прогностический признак низкого текущего риска CIN2+.

Факторы, влияющие на результат
Факторы аналогичны качественному тесту, но критичнее из-за количественной природы:

Нарушение преаналитики: Неправильный забор (недостаток клеток → занижение КВМ и ложное занижение/завышение нагрузки), подготовка (спринцевания → снижение нагрузки), транспортировка/хранение (деградация ДНК → снижение нагрузки).
Неадекватный материал: Низкий КВМ делает результат ненадежным.
Ингибиторы ПЦР: Могут привести к ложноотрицательному результату или занижению нагрузки.
Стадия инфекции: Нагрузка может колебаться. Пик часто при остром заражении или активной CIN.
Локализация забора: Неправильная локализация → ложноотрицательный или заниженный результат.
Метод количественного определения: Точность калибровки и стандартов.
Естественные колебания: Нагрузка может незначительно меняться между тестами без изменения клинического значения.
Недавнее лечение: Приводит к снижению нагрузки.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (ВПЧ ВКР количественный):

Moberg M, Gustavsson I, Gyllensten U. Real-time PCR-based system for simultaneous quantification of human papillomavirus types associated with high risk of cervical cancer. J Clin Microbiol. 2003;41(7):3221-3228. (Пример ранней количественной системы).
Cuschieri K.S, Whitley M.J, Cubie H.A. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence—implications for cervical disease progression and monitoring. J Med Virol. 2004;73(1):65-70. (Связь нагрузки и персистенции).
Lorincz A.T, Castle P.E, Sherman M.E et al. Viral load of human papillomavirus and risk of CIN3 or cervical cancer. Lancet. 2002;360(9328):228-229. (Ключевое исследование о связи нагрузки и риска CIN3).
Dalstein V, Riethmuller D, Pretet J.L et al. Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a longitudinal French cohort study. Int J Cancer. 2003;106(3):396-403. (Прогностическая роль нагрузки).
ДНК-Технология. Инструкция по применению набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека (Human papillomavirus, HPV) высокого канцерогенного риска методом ПЦР в режиме реального времени (ВПЧ ВКР скрин). (Пример инструкции на количественный тест без генотипирования).