Анализ: Бак.посев на грибковую флору + чувствительность к противомикотическим препаратам в Луганске

Краткая История
Микозы (грибковые инфекции) сопровождают человечество на протяжении всей его истории, но их диагностика долгое время оставалась сложной задачей. Хотя дрожжи были описаны еще в XIX веке, а первые попытки культивирования грибов предпринимались, систематическое микологическое исследование клинического материала стало развиваться во второй половине XX века. Это было связано с ростом числа пациентов с иммунодефицитами (ВИЧ, химиотерапия, трансплантация органов), применением мощных антибиотиков широкого спектра, кортикостероидов, что привело к значительному увеличению частоты и тяжести грибковых инфекций. Развитие медицинской микологии привело к созданию специализированных питательных сред (Сабуро, чапек-докса), улучшению методов идентификации (микроскопия, биохимические тесты, хромогенные среды) и, что особенно важно, к разработке методов определения чувствительности грибов к противомикотическим препаратам. Последнее стало критическим в связи с появлением и распространением устойчивых штаммов грибов, особенно Candida non-albicans и плесневых грибов.

Материал, используемый для исследования
Тип материала зависит от локализации подозреваемой грибковой инфекции:

• Кожа, ногти:Соскобы чешуек кожи, ногтевые пластинки, обрезки ногтей, волосы. Собираются стерильным скальпелем или ножницами в стерильный контейнер или на темную бумагу.
• Слизистые оболочки (ротоглотка, влагалище):Мазки/соскобы стерильным зондом или щеточкой с пораженных участков. Для влагалища — отделяемое со стенок. Материал помещают в стерильную пробирку или транспортную среду (например, Amies).
• Мокрота, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛЖ):Собираются в стерильные контейнеры. Мокрота должна быть глубокой, откашлянной.
• Моча:Средняя порция утренней мочи в стерильный контейнер (см. статью 1).
• Кровь:Наиболее важный материал при подозрении на системный кандидоз. Сбор в специальные флаконы для гемокультур (флаконы с бульоном, предназначенные для выделения грибов, например, BACTEC Myco/F Lytic). Объем крови 10-20 мл на флакон (у взрослых), забор из разных вен с интервалом.
• Ликвор (спинномозговая жидкость):Собирается при люмбальной пункции в стерильную пробирку.
• Ткани, биоптаты:Собираются в стерильные контейнеры с физиологическим раствором.
• Другие стерильные жидкости (плевральная, перитонеальная, синовиальная):Аспират в стерильные контейнеры.

Как подготовиться к анализу (Подробно)
Подготовка зависит от типа материала:

1. Общие принципы:
   • Прекращение противогрибковой терапии:По возможности, за 2-4 недели до сбора материала. Если терапия уже начата и прервать ее нельзя, обязательно информировать врача и лабораторию.
   • Гигиена:Для материала со кожи/ногтей/слизистых — не обрабатывать место сбора антисептиками или противогрибковыми мазями/растворами за 2-3 дня до анализа. Для мочи, мокроты — правила гигиены как для бакпосева (см. статьи 1 и 2).
   • Время сбора:Для мочи — утренняя порция. Для мокроты — утренняя, после туалета полости рта. Для крови — при подъеме температуры (при подозрении на фунгемию).
2. Специфическая подготовка:
   • Кожа/Ногти:Помыть участок с мылом и водой, тщательно высушить. Не использовать кремы/мази.
   • Ротовая полость:Не чистить зубы, не полоскать рот, не есть и не пить за 2-3 часа до взятия мазка/соскоба.
   • Влагалище:За 48 часов до — избегать спринцеваний, вагинальных кремов/свечей, тампонов, половых контактов. Не во время менструации.
   • Мокрота:Утром почистить зубы (без пасты или с небольшим количеством), прополоскать рот кипяченой водой. Собрать глубокую мокроту после откашливания.
   • Кровь:Соблюдение правил асептики при заборе крови. Забор до начала эмпирической противогрибковой терапии дает максимальный шанс на выделение возбудителя.
3. Сбор материала медицинским персоналом:Многие виды материала (мазки из зева/влагалища/уретры, соскобы кожи/ногтей, стерильные жидкости) должны собираться только медицинским персоналом с соблюдением стерильности.
4. Транспортировка:Доставить материал в лабораторию как можно скорее (особенно для образцов, не помещенных в транспортную среду). Кровь – немедленно в анализатор гемокультур или термостат. Моча, мокрота – в течение 1-2 часов (можно хранить в холодильнике до 24 часов). Ткани, стерильные жидкости – срочно. Материал для посева на грибы часто требует специальных условий транспортировки.

Описание данного исследования
Посев на грибковую флору – сложный и длительный процесс, требующий специализированных подходов:

1. Обработка материала:Некоторые образцы (мокрота, гной, ткани) могут подвергаться предварительной обработке для уменьшения бактериальной флоры (например, добавление антибиотиков).
2. Посев на селективные среды:
   • Основная среда:Агар Сабуро (Sabouraud Dextrose Agar — SDA) или его модификации. Оптимальна для большинства патогенных грибов.
   • Селективные среды:Среда Сабуро с антибиотиками (хлорамфеникол, гентамицин) и циклогексимидом (ингибитор сапрофитных грибов). Используется для выделения дерматофитов из контаминированных образцов (кожа, ногти). Без циклогексимида – для дрожжей и плесеней, чувствительных к нему.
   • Хромогенные среды:Специальные среды (например, CHROMagar Candida) позволяют дифференцировать основные виды Candida по цвету колоний (C. albicans — зеленый, C. tropicalis — синий, C. krusei — розовый и т.д.) на ранних этапах.
3. Инкубация:
   • Температура:Обычно 25-30°C (оптимум для дерматофитов и многих плесеней) и 35-37°C (оптимум для дрожжей и некоторых системных возбудителей). Часто инкубируют при двух температурах.
   • Сроки:Значительно дольше бактериальных посевов!
     • Дрожжи (Candida, Cryptococcus): Рост через 24-72 часа.
     • Дерматофиты: Рост через 7-14 дней (иногда до 4 недель).
     • Плесневые грибы (Aspergillus, Mucorales, Fusarium): Рост через 2-7 дней.
   • Атмосфера:Обычно аэробные условия. Для некоторых грибов может требоваться CO2.
4. Идентификация:
   • Макро- и микроскопия колоний:Оценка скорости роста, текстуры, цвета колонии. Приготовление нативного препарата (лактофенол хлопчатого синего) или окрашенного препарата для изучения морфологии гриба (гифы, конидии, спорангии, бластоконидии, хламидоспоры) – ключевой метод для плесеней и дерматофитов.
   • Биохимические тесты:Для дрожжей (например, API 20C AUX, VITEK YST) – определение способности утилизировать различные углеводы.
   • Хромогенные среды:Быстрая предварительная идентификация Candida spp.
   • Молекулярные методы (MALDI-TOF MS, ПЦР):Все шире применяются для точной и быстрой идентификации, особенно сложных плесеней и дрожжей.
5. Определение чувствительности к противомикотическим препаратам:
   • Методы:Стандартизированные методы разведений (бульонные микроразведения CLSI M27/M38 или EUCAST E.DEF 9.3/E.DEF 9.4) являются референтными. Определяют минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата.
   • Тестируемые препараты:Зависят от вида гриба и локализации инфекции. Обычно включают:
     • Полиены:Амфотерицин В, нистатин (местно).
     • Азолы:Флуконазол, итраконазол, вориконазол, позаконазол, изувуконазол.
     • Эхинокандины:Каспофунгин, микафунгин, анидулафунгин.
     • Другие:Флуцитозин, тербинафин (для дерматофитов).
   • Интерпретация (S, I, R):Проводится по таблицам CLSI или EUCAST для каждого вида гриба и препарата. Имеет решающее значение для выбора терапии, особенно при инвазивных инфекциях и резистентных возбудителях.

Диагностика заболеваний
Посев на грибковую флору применяется для диагностики широкого спектра микозов:

1. Поверхностные микозы:
   • Дерматофитии (стригущий лишай):Поражение кожи (tinea corporis, tinea cruris, tinea pedis), волосистой части головы (tinea capitis), ногтей (онихомикоз). Возбудители: Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton floccosum.
   • Кандидоз кожи и слизистых:Интертриго, кандидозный стоматит (молочница), вагинит, баланопостит. Возбудитель: Candida spp. (чаще C. albicans, но все чаще C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis).
   • Разноцветный (отрубевидный) лишай:Malassezia furfur.
2. Подкожные микозы:Споротрихоз, хромомикоз, мицетома. Встречаются реже, часто в тропиках.
3. Системные (инвазивные) микозы:Тяжелые, часто угрожающие жизни инфекции:
   • Инвазивный кандидоз:Кандидемия, диссеминированный кандидоз, кандидозный перитонит, эндокардит, менингит, эндофтальмит. Возбудители: Candida spp.
   • Аспергиллез:Инвазивный легочный аспергиллез, аспергиллома, синусит, диссеминированный аспергиллез. Возбудители: Aspergillus fumigatus (чаще всего), A. flavus, A. niger, A. terreus.
   • Криптококкоз:Менингоэнцефалит, легочный криптококкоз (особенно у ВИЧ+). Возбудитель: Cryptococcus neoformans/C. gattii.
   • Мукормикоз (зигомикоз):Рино-орбито-церебральный, легочный, гастроинтестинальный, кожный. Быстро прогрессирующая инфекция. Возбудители: Rhizopus spp., Mucor spp., Lichtheimia spp.
   • Фузариоз:Диссеминированная инфекция у иммунокомпрометированных, кератит, онихомикоз. Возбудитель: Fusarium spp.
   • Пневмоцистная пневмония (PJP):Вызывается Pneumocystis jirovecii (ранее P. carinii). Диагностируется чаще микроскопией или ПЦР, но посев возможен на специальных средах.
   • Эндемичные микозы:Гистоплазмоз, кокцидиоидомикоз, бластомикоз, паракокцидиоидомикоз (распространены в определенных географических зонах).

Цель исследования (Подробно)
Посев на грибковую флору с определением чувствительности преследует ключевые цели:

1. Подтверждение грибковой этиологии заболевания:Установить, что симптомы вызваны именно грибковой инфекцией, а не бактерией, вирусом или неинфекционным процессом.
2. Идентификация возбудителя до вида:Точное определение вида гриба (например, Candida albicans vs C. glabrata; Aspergillus fumigatus vs A. terreus) критически важно, так как:
   • Разные виды имеют разную природную чувствительностьк противогрибковым препаратам (например, C. krusei устойчива к флуконазолу, C. glabrata часто имеет сниженную чувствительность; A. terreus устойчив к амфотерицину В).
   • Определяет прогноззаболевания (некоторые виды более вирулентны).
   • Указывает на возможный источник инфекции(например, катетер-ассоциированный C. parapsilosis).
3. Определение чувствительности к противомикотическим препаратам (Основная цель для системных инфекций):
   • Индивидуализация лечения:Выбор наиболее эффективного и безопасного противогрибкового препарата или комбинации препаратов, к которому данный конкретный штамм чувствителен. Это особенно важно при инвазивных, угрожающих жизни микозах.
   • Оптимизация терапии:Замена неэффективного препарата, снижение дозы токсичного препарата при высокой чувствительности.
   • Выявление резистентности:Первичной (природной) или вторичной (приобретенной в ходе лечения). Резистентность к азолам у Candida spp. и Aspergillus spp., к эхинокандинам у Candida spp., к полиенам у некоторых плесеней – серьезная клиническая проблема.
   • Контроль эффективности лечения:Мониторинг развития резистентности в ходе длительной терапии (например, при хроническом кандидозе, аспергиллезе).
   • Эпидемиологический надзор:Мониторинг циркуляции устойчивых штаммов грибов в стационарах (нозокомиальные вспышки) и популяции.
4. Дифференциальная диагностика:Различить колонизацию (носительство гриба на слизистых или коже без признаков инфекции) и истинную инфекцию. Положительный посев из нестерильных локусов (рот, влагалище, мокрота) требует клинической интерпретации. Посев из стерильных локусов (кровь, ликвор, биоптат) всегда значим.

Что значат полученные результаты (Подробно)
Интерпретация сложна и требует учета клиники, локализации и вида материала.

1. Отрицательный результат / Отсутствие роста:
   • Значение:Грибы не выделены. Может означать:
     • Отсутствие грибковой инфекции.
     • Неправильный сбор/транспортировка.
     • Предшествующая противогрибковая терапия.
     • Недостаточная чувствительность метода или короткий срок инкубации (особенно для дерматофитов и медленно растущих плесеней).
     • Невозможность культивирования данного возбудителя на стандартных средах (например, Pneumocystis jirovecii).
   • Действие:Не исключает микоз полностью. При высоком подозрении – повторить анализ, использовать альтернативные методы (микроскопия, ПЦР, антиген-тесты).
2. Положительный результат / Рост грибов:
   • Значение:Выделен конкретный вид гриба. Ключевое значение имеет:
     • Вид гриба.
     • Локализация, откуда взят материал (стерильный/нестерильный).
     • Клиническая картина.
   • Интерпретация по локализации:
     • Стерильные жидкости/ткани (кровь, ликвор, биоптат, плевральная/перитонеальная жидкость):Любой рост гриба (даже обычно сапрофитного, как Penicillium) считается клинически значимым и требует оценки на предмет инвазивной инфекции. Антибиотикограмма обязательна.
     • Нестерильные локации (кожа, ногти, ротоглотка, влагалище, мокрота, моча):
       • Выделение дерматофитов (Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton) или дрожжей Malassezia:Обычно соответствует инфекции (дерматофития, отрубевидный лишай).
       • Выделение дрожжей Candida spp.:Может быть колонизацией (особенно в ротоглотке, ЖКТ, влагалище у части здоровых людей) или инфекцией. Требует сопоставления с симптомами, количеством (если указано, например, в моче), наличием факторов риска. При симптомах вагинита/баланита или орофарингеального кандидоза у иммунокомпрометированного – значим.
       • Выделение плесневых грибов (Aspergillus, Penicillium, Mucorales и др.) из мокроты или смывов:Чаще всего представляет колонизацию дыхательных путей или контаминацию из воздуха. Может быть значимо у пациентов с высоким риском инвазивного аспергиллеза (нейтропения, трансплантация легких/стволовых клеток) при наличии характерной КТ-картины и клиники. Требует тщательной оценки.
     • Действие:
       • Для стерильных локусов – начало или коррекция противогрибковой терапии на основе вида гриба и антибиотикограммы.
       • Для нестерильных локусов – решение о необходимости лечения принимается на основе клиники, а не только факта роста. Антибиотикограмма обычно проводится при рецидивирующих инфекциях, неэффективности стандартной терапии или выделении видов с природной резистентностью.
       • Антибиотикограмма (если выполнена):Интерпретируется как S (чувствителен), I (промежуточная чувствительность/устойчивость), R (устойчив) для каждого тестированного препарата против данного вида гриба. Определяет выбор препарата:
         • S: Препарат рекомендован для лечения.
         • I: Может быть эффективен при использовании максимальных доз или при локализованной инфекции, где достигаются высокие концентрации. Требует осторожности.
         • R: Препарат не эффективен и не должен использоваться для монотерапии.

Факторы, влияющие на результат (Подробно)

1. Преаналитический этап:
   • Неправильный сбор материала:Недостаточный объем (особенно крови), взятие не из очага, контаминация (особенно для плесеней из воздуха).
   • Отсутствие/неправильная транспортная среда:Для мазков.
   • Нарушение сроков/условий транспортировки и хранения:Грибы чувствительны к высыханию, перепадам температуры. Длительное хранение при комнатной температуре может привести к гибели возбудителя или разрастанию контаминантов.
   • Прием противогрибковых препаратов:Основная причина ложноотрицательных результатов.
   • Местное лечение:Использование кремов, растворов, вагинальных свечей перед забором материала.
2. Аналитический этап:
   • Неадекватная обработка материала:Неэффективное подавление бактериальной флоры в контаминированных образцах.
   • Ошибки в выборе среды:Использование неселективных сред для контаминированных образцов или сред с циклогексимидом для чувствительных к нему грибов (Cryptococcus, некоторые плесени).
   • Неоптимальные условия инкубации:Неправильная температура, отсутствие CO2 (для некоторых грибов), недостаточная влажность.
   • Недостаточный срок инкубации:Особенно для дерматофитов (недели) и медленно растущих грибов. Преждевременная выдача отрицательного результата.
   • Ошибки идентификации:Сложность морфологической идентификации многих плесеней и дрожжей. Необходимость в опытном микологе или молекулярных методах.
   • Ошибки при определении чувствительности:Несоблюдение стандартизированных методик (CLSI/EUCAST), использование неправильного инокулюма, субъективность в определении конечной точки (МПК).
3. Биологические факторы:
   • Интермиттирующее выделение:Грибы могут выделяться с материалом непостоянно.
   • Низкая концентрация возбудителя:В стерильных жидкостях на фоне лечения или при хронической инфекции.
   • Характер возбудителя:Некоторые грибы (например, возбудители мукормикоза) плохо растут на стандартных средах или дают стерильный мицелий, затрудняя идентификацию.

Заключение
Бактериологический посев на грибковую флору с определением чувствительности к противомикотическим препаратам – краеугольный камень диагностики микозов, особенно инвазивных форм. Он позволяет не только подтвердить диагноз и идентифицировать возбудителя, но и, что жизненно важно, определить его чувствительность к лекарствам, что является основой для эффективной и рациональной терапии в условиях роста резистентности. Длительность исследования и технические сложности окупаются его высокой диагностической ценностью. Строгое соблюдение правил сбора, транспортировки и использование лабораторией специализированных микотических методик – залог успеха.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы:

1. Клинические рекомендации «Кандидоз». Министерство здравоохранения Российской Федерации, Национальное научное общество инфекционистов (ННОИ), 2020 (Актуальная версия). (Рус.)
2. Васильева Н.В., Климко Н.Н. «Современные подходы к лабораторной диагностике инвазивных микозов». Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(2): 106-118. (Рус.)
3. Cuenca-Estrella M, Verweij PE, Arendrup MC, Arikan-Akdagli S, Bille J, Donnelly JP, Jensen HE, Lass-Flörl C, Richardson MD, Akova M, Bassetti M, Calandra T, Castagnola E, Cornely OA, Garbino J, Groll AH, Herbrecht R, Hope WW, Kullberg BJ, Lortholary O, Meersseman W, Petrikkos G, Roilides E, Viscoli C, Ullmann AJ; ESCMID Fungal Infection Study Group. ESCMID* guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012: diagnostic procedures. Clin Microbiol Infect. 2012 Dec;18 Suppl 7:9-18. doi: 10.1111/1469-0691.12038. PMID: 23137135. (*European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases).
4. Ullmann AJ, Aguado JM, Arikan-Akdagli S, Denning DW, Groll AH, Lagrou K, Lass-Flörl C, Lewis RE, Munoz P, Verweij PE, Warris A, Ader F, Akova M, Arendrup MC, Barnes RA, Beigelman-Aubry C, Blot S, Bouza E, Brüggemann RJM, Buchheidt D, Cadranel J, Castagnola E, Chakrabarti A, Cuenca-Estrella M, Dimopoulos G, Fortun J, Gangneux JP, Garbino J, Heinz WJ, Herbrecht R, Heussel CP, Kibbler CC, Klimko N, Kullberg BJ, Lange C, Lehrnbecher T, Löffler J, Lortholary O, Maertens J, Marchetti O, Meis JF, Pagano L, Ribaud P, Richardson M, Roilides E, Ruhnke M, Sanguinetti M, Sheppard DC, Sinkó J, Skiada A, Vehreschild MJGT, Viscoli C, Cornely OA. Diagnosis and management of Aspergillus diseases: executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline. Clin Microbiol Infect. 2018 May;24 Suppl 1:e1-e38. doi: 10.1016/j.cmi.2018.01.002. PMID: 29544767. (ECMM — European Confederation of Medical Mycology).
5. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. 4th ed. CLSI standard M27. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2017. / CLSI. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi. 3rd ed. CLSI standard M38. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2017. (Основные международные стандарты на методы определения чувствительности).