Архивы: Анализ

 

ДНК Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В, СГВ) методом ПЦР (качественное и количественное определение)

 

Краткая История

Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) был впервые выделен в 1930-х годах как возбудитель мастита у крупного рогатого скота. В 1938 году он был впервые описан как причина послеродового сепсиса у женщин. В 1960-1970-х годах было установлено, что S. agalactiae является ведущей причиной неонатального сепсиса, пневмонии и менингита у новорожденных (как ранний – первые 7 дней жизни, так и поздний – 7-90 дней). Материнская колонизация влагалища и прямой кишки S. agalactiae является основным фактором риска инфицирования новорожденного (вертикальная передача во время родов). Долгое время «золотым стандартом» диагностики колонизации S. agalactiae у беременных был культуральный метод (посев на селективные питательные среды – агар с добавлением крови, гентамицина, налидиксовой кислоты, коломицина, а также среда Todd-Hewitt с добавками), который требует 48-72 часа. В 1990-2000-х годах, с развитием полимеразной цепной реакции (ПЦР), стало возможным быстрое (4-6 часов) и высокочувствительное выявление ДНК S. agalactiae в урогенитальных образцах (влагалищный мазок, ректальный мазок). В 2000-2010-х годах были разработаны коммерческие тест-системы для ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR), позволяющие не только обнаруживать S. agalactiae, но и определять его количество, а также выявлять гены устойчивости к антибиотикам (макролиды, линкозамиды, тетрациклины, фторхинолоны). Сегодня ПЦР на S. agalactiae широко используется для скрининга беременных (в 35-37 недель беременности) для выявления колонизации и назначения интранатальной антибиотикопрофилактики (во время родов) для предотвращения раннего неонатального сепсиса.

 

Материал, используемый для исследования

• • Тип образца:Урогенитальный и ректальный соскоб (эпителиальные клетки слизистых оболочек).
  • Локализация забора материала:

• У беременных (основное показание):Комбинированный мазок – соскоб из нижней трети влагалища (не из цервикального канала) + соскоб из перианальной области (прямой кишки) (на глубину 2-3 см). Это наиболее чувствительный метод (выявляет колонизацию у 95-98% носителей). Забор материала проводят в 35-37 недель беременности (оптимально за 4-6 недель до предполагаемых родов).
• У небеременных женщин (при хронических воспалительных заболеваниях, невынашивании, перед гинекологическими операциями):Влагалищный мазок (нижняя треть влагалища) + ректальный мазок.
• У мужчин (редко, при уретрите, простатите, эпидидимите):Соскоб из уретры, первая порция утренней мочи, эякулят, секрет предстательной железы.
  • Тип пробирки/системы сбора:Специальная пробирка с транспортной средой для ПЦР (содержит консервант, предотвращающий деградацию ДНК и рост бактерий). Используются коммерческие системы: «Инцит-тампон» (Incyte Swab), пробирки с транспортной средой для ПЦР (например, «ДНК-сорб», «АмплиСенс», «Эппендорф»). Важно: Обычные мазки на стекле для ПЦР не пригодны (необходим транспорт для сохранения ДНК). Для мужчин – стерильный пластиковый контейнер для первой порции утренней мочи (10-20 мл).
  • Объем материала:Достаточное количество эпителиальных клеток. Недостаточное количество клеток – причина ложноотрицательных результатов.
  • Обработка:После взятия материала тампон/зонд тщательно споласкивается в транспортной среде (несколько вращательных движений), затем отжимается о стенки пробирки и удаляется. Пробирка плотно закрывается и маркируется (ФИО пациента, дата, время взятия, локализация). Доставка в лабораторию осуществляется в день взятия (или в течение 12 часов при хранении при +2…+8°C). Замораживание не допускается. Стабильность ДНК в транспортной среде при комнатной температуре – до 21 дня (в зависимости от системы сбора), при +2…+8°C – до 24-48 часов.

 

Как подготовиться к анализу

Подготовка к анализу критически важна для получения достоверного результата (исключение ложноотрицательных результатов):

Беременные (скрининг в 35-37 недель):

• За 3 днядо взятия материала исключить: половые контакты, вагинальные спринцевания, использование вагинальных свечей, таблеток, кремов, гелей, тампонов.
• За 5-7 днейдо взятия материала прекратить использование антибактериальных препаратов местно (вагинально) и системно (внутрь, инъекционно) – после консультации с врачом (нельзя отменять жизненно важные препараты!).
• В день взятия материала не проводить гигиенические процедуры с использованием антисептиков для подмывания (только чистая вода).
• Важно:Скрининг на S. agalactiae проводится однократно в 35-37 недель (даже если предыдущие посевы/ПЦР были отрицательными). Результат действителен в течение 5-6 недель. Если с момента взятия мазка прошло более 6 недель до родов – скрининг нужно повторить (особенно при преждевременных родах или при наличии факторов риска).

 

Небеременные женщины:

• Исследование рекомендуется проводить до менструации или через 2-5 дней после её окончания.
• За 3 днядо взятия материала исключить: половые контакты, вагинальные спринцевания, использование вагинальных свечей, таблеток, кремов, гелей, тампонов.
• За 5-7 днейдо взятия материала прекратить использование антибактериальных препаратов местно (вагинально) и системно (внутрь, инъекционно) – после консультации с врачом.
• В день взятия материала не проводить гигиенические процедуры с использованием антисептиков для подмывания (только чистая вода).

 

Мужчины:

• За 3 днядо взятия материала исключить половые контакты.
• За 5-7 днейдо взятия материала прекратить прием антибактериальных препаратов (после консультации с врачом).
• Для соскоба из уретры:Перед взятием материала не мочиться в течение 3-4 часов.
• Для первой порции утренней мочи:Собирают первую утреннюю порцию мочи (10-20 мл) после ночного сна (за 3-4 часа до сбора мочи не мочиться). Собирают в стерильный пластиковый контейнер.

 

Общие требования:

• За 2-3 неделидо исследования исключить прием антибиотиков (системно) – по согласованию с врачом (особенно пенициллинов, ампициллина, амоксициллина, цефалоспоринов, макролидов, линкозамидов – клиндамицин, тетрациклинов, ванкомицина). S. agalactiae чувствителен к пенициллину, и даже короткий курс антибиотиков может привести к ложноотрицательному результату ПЦР.
• Сообщить врачу о наличии острых инфекционных заболеваний (лихорадка, ОРВИ, ангина) – анализ следует отложить на 2-4 недели после выздоровления.
• Исключить употребление алкоголя за 24 часа до исследования.
• В день взятия материала не курить за 1-2 часа (по возможности).

 

Описание данного вещества (Streptococcus agalactiae и метод ПЦР)

Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В, СГВ) – это грамположительный, факультативно-анаэробный, каталазоотрицательный, бета-гемолитический (гемолиз на кровяном агаре – зона просветления вокруг колоний) стрептококк, относящийся к группе В по классификации Лэнсфилда (на основе капсульного полисахаридного антигена). Является условно-патогенным микроорганизмом, колонизирует слизистые оболочки нижних отделов желудочно-кишечного тракта (прямая кишка) и урогенитального тракта (влагалище, уретра). У здоровых небеременных женщин колонизация S. agalactiae встречается у 10-30% (бессимптомное носительство). При беременности частота колонизации возрастает до 20-40% (из-за изменения гормонального фона, повышения pH влагалища). В большинстве случаев колонизация протекает бессимптомно и не причиняет вреда матери. Однако во время родов S. agalactiae может передаваться новорожденному (вертикальная передача) и вызывать тяжелые инфекции: ранний неонатальный сепсис (0-6 дней жизни), пневмонию, менингит, поздний неонатальный сепсис (7-90 дней). Также S. agalactiae может вызывать инфекции у взрослых (особенно у пожилых, иммунокомпрометированных, пациентов с сахарным диабетом): сепсис, пневмонию, инфекции кожи и мягких тканей, эндометрит, послеродовой сепсис, инфекции мочевыводящих путей, эндокардит, артрит, менингит.

 

Факторы вирулентности S. agalactiae:

• Капсульный полисахарид:Основной фактор вирулентности. Выделяют 10 серотипов (Ia, Ib, II-IX). Капсула препятствует фагоцитозу, подавляет активацию комплемента.
• Белок C (альфа- и бета-белки):Участвуют в адгезии к эпителию, инвазии в клетки, устойчивости к фагоцитозу.
• Гемолизин (пигмент, фактор CAMP):Разрушает эритроциты, повреждает ткани. Положительная CAMP-реакция (синергизм со Staphylococcus aureus) используется для идентификации S. agalactiae.
• Биопленка:Обеспечивает персистенцию на слизистых и медицинских устройствах (катетеры, протезы).
• Ферменты (гиалуронидаза, нейраминидаза, ДНКаза, протеазы):Повреждают ткани, способствуют распространению инфекции.

 

Клиническое значение S. agalactiae в акушерстве и неонатологии:

 

У беременных (колонизация, 20-40%):

• Бессимптомное носительство (90%).
• Бактериурия (бессимптомная или симптомный цистит/пиелонефрит).
• Хориоамнионит (воспаление плодных оболочек), преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек.
• Послеродовой эндометрит (лихорадка, боли внизу живота, гнойные лохии), послеродовой сепсис.

 

У новорожденных (вертикальная передача во время родов):

• Ранний неонатальный сепсис (0-6 дней жизни, чаще в первые 24-48 часов):Пневмония (одышка, тахипноэ, цианоз), сепсис (лихорадка или гипотермия, вялость, отказ от еды, тахикардия, гипотензия), менингит (ригидность затылочных мышц, выбухание родничка, судороги). Летальность 5-20% (выше у недоношенных).
• Поздний неонатальный сепсис (7-90 дней, в среднем 3-4 недели):Чаще менингит (лихорадка, вялость, раздражительность, судороги), реже – бактериемия, артрит, остеомиелит. Летальность 2-6%. Источник – колонизация при родах (вертикальная передача) или госпитальная инфекция.

 

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция):

• Качественная ПЦР:Определяет наличие (обнаружено/не обнаружено) ДНК S. agalactiae в образце. Не позволяет оценить количество бактерий. Чувствительность метода – 10-100 копий ДНК в пробе. Специфичность – 98-100%. Чувствительность ПЦР (95-98%) выше, чем культурального метода (85-90%), особенно при низкой бактериальной нагрузке и при приеме антибиотиков.
• Количественная ПЦР (Real-Time PCR):Позволяет не только обнаружить ДНК S. agalactiae, но и определить её количество (КОЕ/мл или геном-эквивалент/мл). Это важно для оценки степени колонизации (высокая бактериальная нагрузка > 10^5 КОЕ/мл ассоциирована с более высоким риском вертикальной передачи новорожденному). Однако для принятия решения об интранатальной антибиотикопрофилактике достаточно качественного обнаружения (любое количество).
• Мультиплексная ПЦР (сочетанное выявление нескольких возбудителей):Одновременное выявление S. agalactiae, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans и других. Может использоваться для комплексной оценки микробиоты влагалища.
• Специфичность:Высокая (98-100%). Современные праймеры специфичны к ДНК S. agalactiae (например, к генам cfb (фактор CAMP), scpB (C5a-пептидаза), 16S рРНК, cylE (гемолизин), gbs2018) и не перекрестно реагируют с другими стрептококками (S. pyogenes – стрептококк группы А, S. pneumoniae, S. viridans, энтерококки).
• Чувствительность:Очень высокая (95-98% для комбинированного влагалищно-ректального мазка). Чувствительность зависит от типа материала, стадии заболевания, приема антибиотиков.

 

Диагностика заболеваний

Качественное (и количественное) определение ДНК Streptococcus agalactiae используется для:

1. Скрининга беременных (35-37 недель беременности) для выявления колонизации S. agalactiae и назначения интранатальной антибиотикопрофилактики:Это основное и самое важное показание. Цель – предотвратить ранний неонатальный сепсис. Все беременные должны быть обследованы на S. agalactiae в 35-37 недель (независимо от предыдущих результатов). Если ПЦР положительная (или культуральный посев положительный), во время родов (с момента начала родовой деятельности или отхождения околоплодных вод) внутривенно вводят антибиотики (пенициллин G, ампициллин, при аллергии на пенициллин – цефазолин, клиндамицин, ванкомицин). Интранатальная антибиотикопрофилактика снижает риск раннего неонатального сепсиса с 1-2% до 0,1-0,2% у новорожденных от матерей-носителей.
2. Обследования беременных с факторами риска преждевременных родов (предшествующие преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек, хориоамнионит):Обнаружение S. agalactiae (особенно в высоком титре) является показанием для активного ведения и антибактериальной терапии (интранатально).
3. Обследования новорожденных с подозрением на ранний неонатальный сепсис (одышка, лихорадка, вялость):ПЦР крови, ликвора (при подозрении на менингит), мазка из зева, ушей, пупка. Быстрый результат (4-6 часов) позволяет своевременно начать антибактериальную терапию (ампициллин + гентамицин, или ампициллин + цефотаксим).
4. Диагностики инфекций мочевыводящих путей (цистит, пиелонефрит) у беременных и небеременных: agalactiae является одной из причин инфекций мочевыводящих путей (5-10% случаев). ПЦР мочи (культуральный посев также используется, но ПЦР быстрее).
5. Обследования при невынашивании беременности, преждевременных родах, преждевременном разрыве плодных оболочек, хориоамнионите: agalactiae может быть этиологической причиной. Выявление S. agalactiae во влагалищно-ректальном мазке у женщин с этими осложнениями требует лечения.
6. Обследования при послеродовом эндометрите и послеродовом сепсисе:ПЦР лохий, крови (при сепсисе).
7. Диагностики инвазивных инфекций у взрослых (сепсис, пневмония, эндокардит, артрит, менингит) – у пациентов с сахарным диабетом, хроническими заболеваниями печени/почек, онкологическими заболеваниями, после спленэктомии, у пожилых: agalactiae является одной из причин этих инфекций (особенно у иммунокомпрометированных). ПЦР крови, ликвора, плевральной жидкости, синовиальной жидкости, абсцессов.
8. Обследования перед гинекологическими операциями (гистероскопия, выскабливание, аборт, установка ВМС, ЭКО):Для выявления колонизации S. agalactiae и проведения антибактериальной профилактики (для снижения риска восходящей инфекции, эндометрита, сепсиса).
9. Обследования половых партнеров (при рецидивирующих инфекциях, невынашивании, бесплодии): agalactiae может передаваться половым путем (но не считается классической ИППП, так как колонизация может быть и неполовой этиологии). Лечение полового партнера рекомендуется при рецидивирующих инфекциях у женщины.

 

Цель исследования

Основные цели качественного (и количественного) определения ДНК Streptococcus agalactiae:

1. Скрининг беременных (35-37 недель) для выявления колонизации и назначения интранатальной антибиотикопрофилактики (снижение риска раннего неонатального сепсиса).
2. Диагностика инфекций мочевыводящих путей (цистит, пиелонефрит) у беременных и небеременных.
3. Диагностика послеродового эндометрита и сепсиса.
4. Диагностика раннего и позднего неонатального сепсиса, пневмонии, менингита у новорожденных.
5. Диагностика инвазивных инфекций (сепсис, пневмония, эндокардит, артрит, менингит) у иммунокомпрометированных взрослых и пожилых.
6. Обследование при невынашивании беременности, преждевременных родах, преждевременном разрыве плодных оболочек, хориоамнионите.
7. Обследование перед гинекологическими операциями и манипуляциями (для профилактики послеоперационных осложнений).

 

Что значат полученные результаты

Интерпретация результатов определения ДНК Streptococcus agalactiae всегда проводится врачом-акушером-гинекологом, неонатологом, терапевтом, инфекционистом в контексте клинической ситуации (беременность, срок беременности, наличие симптомов инфекции мочевыводящих путей, послеродовой лихорадки, неонатального сепсиса). Референсное значение – «не обнаружено» (для качественной ПЦР) .

 

Референсные значения (качественная ПЦР):

• Отрицательный результат («не обнаружено»):ДНК Streptococcus agalactiae в исследуемом образце не обнаружена (или концентрация ниже предела чувствительности метода, обычно < 10-100 копий ДНК). Колонизация S. agalactiae маловероятна. Однако при отрицательном результате, но наличии клинических симптомов (инфекция мочевыводящих путей, послеродовой эндометрит, неонатальный сепсис) – возможно, возбудитель другой (E. coli, другие стрептококки, стафилококки, клебсиелла). Рекомендуется культуральный посев (для идентификации возбудителя и определения чувствительности к антибиотикам).
• Положительный результат («обнаружено»):ДНК Streptococcus agalactiae обнаружена в исследуемом образце. Указывает на колонизацию S. agalactiae (у беременных – показание к интранатальной антибиотикопрофилактике). agalactiae может быть частью нормальной микрофлоры (у 10-30% небеременных женщин, у 20-40% беременных), но у беременных любое обнаружение (даже в низком титре) является показанием к профилактике, так как даже низкая бактериальная нагрузка может привести к вертикальной передаче новорожденному и тяжелому неонатальному сепсису.

 

Количественная ПЦР (Real-Time PCR, количество ДНК в КОЕ/мл или геном-эквивалент/мл):

• < 10^2 – 10^3 КОЕ/мл (низкая бактериальная нагрузка):Низкая степень колонизации. У беременных – все равно показана интранатальная антибиотикопрофилактика (риск вертикальной передачи сохраняется). Лечение (антибиотики до родов) обычно не требуется (только при инфекции мочевыводящих путей, хориоамнионите, преждевременных родах).
• 10^3 – 10^5 КОЕ/мл (умеренная бактериальная нагрузка):Умеренная колонизация. У беременных – интранатальная антибиотикопрофилактика обязательна.
• > 10^5 КОЕ/мл (высокая бактериальная нагрузка):Высокая степень колонизации. У беременных – высокий риск вертикальной передачи (до 50-60%). Интранатальная антибиотикопрофилактика обязательна. При наличии симптомов инфекции мочевыводящих путей, хориоамнионита – лечение до родов (амоксициллин, ампициллин, цефалоспорины, макролиды – в зависимости от чувствительности).

 

Интерпретация в зависимости от клинической ситуации:

 

Беременная, 35-37 недель, положительный ПЦР (любая нагрузка), без симптомов:

• Интерпретация:Бессимптомная колонизация S. agalactiae. Показана интранатальная антибиотикопрофилактика (во время родов, внутривенно пенициллин G, ампициллин или альтернативные препараты). Лечение до родов (пероральными антибиотиками) не рекомендуется (не снижает риск вертикальной передачи, но способствует развитию устойчивости). Исключение – бактериурия (даже бессимптомная) – требует лечения амоксициллином/ампициллином 7 дней.

 

Беременная, 35-37 недель, положительный ПЦР + симптомы инфекции мочевыводящих путей (дизурия, частые позывы, боль в пояснице, лихорадка):

• Интерпретация:Цистит или пиелонефрит, вызванный S. agalactiae. Требует лечения антибиотиками (амоксициллин/ампициллин 7-10 дней, цефалоспорины, макролиды) + интранатальная антибиотикопрофилактика во время родов.

 

Беременная, 35-37 недель, положительный ПЦР + угроза преждевременных родов, преждевременный разрыв плодных оболочек, хориоамнионит (лихорадка, боли внизу живота, гнойные выделения):

• Интерпретация: agalactiae – вероятная причина осложнений. Требует срочного лечения антибиотиками (ампициллин + гентамицин, или цефтриаксон, или эритромицин) + родоразрешение (по акушерской ситуации).

 

Роженица (в родах), положительный ПЦР (скрининг не проводился, или результат получен экспресс-методом):

• Интерпретация:Колонизация S. agalactiae. Требует немедленной интранатальной антибиотикопрофилактики (внутривенно пенициллин G, ампициллин). Даже если роды уже начались, антибиотики вводят до рождения ребенка (за 4 часа до родов – максимальная эффективность).

 

Родильница (послеродовой период, лихорадка, боли внизу живота, гнойные лохии):

• Интерпретация:Послеродовой эндометрит (вероятная причина – S. agalactiae). Требует лечения антибиотиками (ампициллин + гентамицин, клиндамицин + гентамицин, цефтриаксон). ПЦР лохий (или культуральный посев) для подтверждения.

 

Новорожденный (первые 6 дней жизни) с симптомами (одышка, лихорадка, вялость, отказ от еды):

• Интерпретация:Подозрение на ранний неонатальный сепсис. Положительный ПЦР S. agalactiae (кровь, ликвор, мазки) подтверждает диагноз. Требует немедленной антибактериальной терапии (ампициллин + гентамицин, или ампициллин + цефотаксим). Длительность лечения 10-14 дней (при менингите – 14-21 день).

 

Новорожденный (7-90 дней) с симптомами (лихорадка, вялость, судороги):

• Интерпретация:Подозрение на поздний неонатальный менингит/сепсис. Положительный ПЦР S. agalactiae (ликвор, кровь) подтверждает диагноз. Требует лечения (ампициллин + цефотаксим, или ванкомицин + цефотаксим – при неизвестной чувствительности).

 

Небеременная женщина (рецидивирующий бактериальный вагиноз, невынашивание, бесплодие), положительный ПЦР (высокая нагрузка, > 10^4-10^5 КОЕ/мл):

• Интерпретация: agalactiae может играть этиологическую роль (особенно при рецидивах, при невынашивании). Требует лечения (амоксициллин/ампициллин 7 дней, джозамицин, клиндамицин). Лечение полового партнера – рекомендуется (хотя данные противоречивы).

 

Небеременная женщина (без симптомов), положительный ПЦР (низкая нагрузка, < 10^4 КОЕ/мл):

• Интерпретация:Бессимптомное носительство S. agalactiae (вариант нормы, встречается у 10-30% женщин). Лечение не требуется. При планировании беременности – скрининг не ранее 35-37 недель (повторно, так как колонизация может исчезнуть и появиться вновь).

 

Важные нюансы интерпретации:

• agalactiae – условно-патогенный микроорганизм (не облигатный патоген, в отличие от N. gonorrhoeae, C. trachomatis).У небеременных женщин и мужчин колонизация часто не требует лечения (только при симптомах, при высоком риске инфекции – иммунодефицит, сахарный диабет, перед операциями). Однако у беременных ЛЮБОЕ обнаружение S. agalactiae (даже в низком титре) является показанием к интранатальной антибиотикопрофилактике (для предотвращения раннего неонатального сепсиса).
• Ложноположительный результат:Возможен при контаминации образца (несоблюдение правил асептики, загрязнение реагентов). Частота ложноположительных результатов в хорошо организованных лабораториях составляет менее 1%.
• Ложноотрицательный результат:Возможен при неправильном взятии материала (недостаточное количество эпителиальных клеток, не взяли ректальный мазок – чувствительность влагалищного мазка без ректального составляет 70-80%), при длительном хранении образца (деградация ДНК), при подавлении ПЦР (ингибиторы в образце – кровь, слизь, препараты для местного лечения), при очень низкой концентрации S. agalactiae (ниже предела чувствительности), при приеме антибиотиков до анализа.
• Скрининг в 35-37 недель – «золотой стандарт»:Результат действителен в течение 5-6 недель. Если роды наступают более чем через 6 недель после взятия мазка (например, при перенашивании беременности), скрининг необходимо повторить (так как колонизация может измениться). Если роды наступают до 35-37 недель (преждевременные), скрининг не проводился, но есть факторы риска (предшествующий ребенок с неонатальным сепсисом, бактериурия во время беременности, преждевременные роды в анамнезе, лихорадка в родах > 38°C) – интранатальная антибиотикопрофилактика назначается без скрининга (эмпирически).
• Интранатальная антибиотикопрофилактика:Назначается внутривенно (пенициллин G 5 млн ЕД нагрузка, затем 2,5-3 млн ЕД каждые 4 часа до родов, или ампициллин 2 г нагрузка, затем 1 г каждые 4 часа). При аллергии на пенициллин (неанафилактическая) – цефазолин 2 г нагрузка, затем 1 г каждые 8 часов. При аллергии на пенициллин (анафилактическая) – клиндамицин 900 мг внутривенно каждые 8 часов, или ванкомицин (при устойчивости к клиндамицину). Профилактика эффективна, если антибиотики введены за 4 часа до родов.
• Резистентность S. agalactiae к антибиотикам:К пенициллину и ампициллину резистентность отсутствует (100% чувствительность). К макролидам (эритромицин, азитромицин, джозамицин) – резистентность 10-30% (в разных регионах). К линкозамидам (клиндамицин) – резистентность 5-20%. К тетрациклинам – резистентность 80-90% (не используются). К фторхинолонам (левофлоксацин, моксифлоксацин) – резистентность 10-30%. При аллергии на пенициллин рекомендуется проводить тестирование на чувствительность к клиндамицину (или использовать ванкомицин, цефазолин).

 

Факторы, влияющие на результат

На результат определения ДНК Streptococcus agalactiae могут влиять различные преаналитические, аналитические и биологические факторы:

 

Преаналитические (до взятия материала):

• Прием антибиотиковза 2-4 недели до анализа – приводит к ложноотрицательным результатам (снижение бактериальной нагрузки, разрушение ДНК). Это самый частый фактор ложноотрицательных результатов. Особенно важны пенициллины (амоксициллин, ампициллин), цефалоспорины, макролиды (азитромицин, джозамицин), клиндамицин, ванкомицин, тетрациклины, фторхинолоны.
• Использование вагинальных свечей, кремов, спринцеванийза 3-5 дней до анализа – может смывать эпителиальные клетки и удалять ДНК возбудителя (ложноотрицательный результат).
• Половой акт за 3 дня до анализа– может временно изменять микробиоту урогенитального тракта.
• Менструация– кровь содержит ингибиторы ПЦР, может вызывать ложноотрицательные результаты. Анализ сдают после окончания менструации.
• Недостаточное количество эпителиальных клетокв соскобе – причина ложноотрицательных результатов. Важно: Комбинированный влагалищно-ректальный мазок (оба участка) повышает чувствительность с 70-80% (только влагалище) до 95-98%.
• Несоблюдение правил асептикипри взятии материала – контаминация образца посторонней ДНК (ложноположительный результат).

 

Аналитические (на этапе лабораторного исследования):

• Контаминация реагентов и лабораторной посудыампликонами (продуктами ПЦР) – ложноположительный результат. Современные лаборатории используют системы с УФ-деконтаминацией и раздельные зоны для выделения ДНК и амплификации.
• Ингибиторы ПЦРв образце (кровь, слизь, препараты для местного лечения) – ложноотрицательный результат. Требуется специальная пробоподготовка (очистка ДНК).
• Нарушение температурного режима хранения транспортной среды(замораживание, перегрев) – деградация ДНК (ложноотрицательный результат).
• Чувствительность тест-системы:Разные коммерческие наборы имеют разную чувствительность (10-100 копий ДНК). Высокочувствительные тесты предпочтительнее для скрининга беременных.
• Специфичность праймеров:Должна быть высокой, чтобы не перекрестно реагировать с другими стрептококками (S. pyogenes, S. pneumoniae, S. viridans, энтерококки). Современные коммерческие наборы используют высокоспецифичные праймеры к генам cfb (CAMP-фактор), scpB, cylE, gbs2018.

 

Биологические факторы:

• Беременность– повышает частоту колонизации S. agalactiae (20-40% против 10-30% у небеременных). Гормональные изменения, повышение pH влагалища способствуют росту стрептококков.
• Сахарный диабет– повышенный риск колонизации и инвазивных инфекций.
• ВИЧ-инфекция (иммуносупрессия)– повышенный риск инвазивных инфекций (сепсис, пневмония, эндокардит, менингит). Скрининг на S. agalactiae рекомендуется ВИЧ-инфицированным беременным (как и всем беременным).
• Колонизация может быть транзиторной:У одной и той же женщины колонизация может исчезать и появляться вновь (поэтому скрининг в 35-37 недель, а не ранее).

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

---

Список литературы:

1. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Беременность и роды при колонизации стрептококком группы В». 2021.
2. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Неонатальный сепсис». 2021.
3. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Инфекции мочевыводящих путей у беременных». 2020.
4. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease: Revised Guidelines from CDC, 2010. MMWR. 2010;59(RR-10):1-36.
5. Verani J.R., McGee L., Schrag S.J. Prevention of perinatal group B streptococcal disease – revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recommendations and Reports. 2010;59(RR-10):1-36.

 

ДНК цитомегаловируса (ЦМВ, CMV) методом ПЦР (качественное и количественное определение)

 

Краткая История

Цитомегаловирус (ЦМВ, Human herpesvirus type 5) был открыт в 1956 году независимо Маргарет Смит (США) и Уильямом Роу (США) при исследовании тканей детей с цитомегалией («гигантоклеточной» инклюзией). Долгое время диагностика ЦМВ-инфекции основывалась на вирусологических (выделение вируса в культуре клеток – 2-6 недель) и серологических методах (определение IgM и IgG). Однако эти методы не позволяли выявить активную репликацию вируса (особенно у иммунокомпрометированных пациентов) и оценить эффективность противовирусной терапии. В 1990-х годах, с развитием полимеразной цепной реакции (ПЦР), стало возможным быстрое (4-6 часов) и высокочувствительное выявление ДНК ЦМВ в различных биологических жидкостях (кровь, моча, ликвор, слюна, амниотическая жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, биоптаты). В 2000-2010-х годах были разработаны коммерческие тест-системы для количественной ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR), позволяющие не только обнаруживать ДНК ЦМВ, но и определять вирусную нагрузку (количество копий ДНК/мл). Это стало критически важным для мониторинга ЦМВ-инфекции у иммунокомпрометированных пациентов (реципиенты трансплантатов, ВИЧ-инфицированные, онкогематологические больные), для прогнозирования риска развития ЦМВ-болезни, для оценки эффективности противовирусной терапии (ганцикловир, валганцикловир, фоскарнет, цидофовир, летермовир), а также для диагностики врожденной ЦМВ-инфекции у новорожденных. Сегодня количественная ПЦР является «золотым стандартом» диагностики активной ЦМВ-инфекции и мониторинга ЦМВ-реактивации.

 

Материал, используемый для исследования

 

Тип образца:В зависимости от клинических проявлений и цели исследования:

• Кровь (плазма, цельная кровь, лейкоцитарная масса):Основной материал для диагностики активной ЦМВ-инфекции (виремии) и мониторинга ЦМВ-реактивации у иммунокомпрометированных пациентов. Плазма – предпочтительнее для количественной ПЦР (отражает свободный вирус). Цельная кровь или лейкоцитарная масса – более чувствительны (вирус находится внутри лейкоцитов), но дают более высокие значения.
• Моча:Для диагностики ЦМВ-инфекции у новорожденных (врожденная ЦМВ-инфекция), у детей, у взрослых при поражении почек. ЦМВ выделяется с мочой длительно (месяцы, годы), поэтому положительная ПЦР мочи не всегда означает активную инфекцию (может быть латентная с периодическим выделением вируса).
• Слюна:Скрининг новорожденных на врожденную ЦМВ-инфекцию (высокая чувствительность, неинвазивно). Положительный результат требует подтверждения ПЦР крови или мочи (так как в слюне вирус может быть транзиторным).
• Ликвор (спинномозговая жидкость):При подозрении на ЦМВ-энцефалит, менингит, миелит (у ВИЧ-инфицированных, реципиентов трансплантатов, новорожденных).
• Амниотическая жидкость:Для пренатальной диагностики врожденной ЦМВ-инфекции (при первичной ЦМВ-инфекции у беременной). Забор – после 21-22 недель беременности и через 6-8 недель после предполагаемой даты инфицирования матери.
• Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), биоптат легкого:При подозрении на ЦМВ-пневмонию.
• Биоптат печени, кишечника, пищевода, сетчатки, почек, тканей ЦНС:При подозрении на ЦМВ-поражение соответствующих органов (у иммунокомпрометированных).
• Стекловидное тело (влага глаза):При ЦМВ-ретините (у ВИЧ-инфицированных).
• Грудное молоко:У матерей с активной ЦМВ-инфекцией (для оценки риска передачи новорожденному через молоко).

 

Тип пробирки/системы сбора:

• Для крови:Вакуумная пробирка с ЭДТА (фиолетовая крышечка) или с цитратом (синяя крышечка). Важно: Не использовать пробирки с гепарином (зеленая крышечка), так как гепарин ингибирует ПЦР. Плазму отделяют центрифугированием в течение 2-4 часов после взятия.
• Для мочи, слюны, ликвора, амниотической жидкости, БАЛ, биоптатов:Стерильные пластиковые контейнеры или пробирки. Для длительного хранения (более 24 часов) – замораживание при -20°C или -70°C.
• Для соскобов (урогенитальный тракт, конъюнктива):Специальная пробирка с транспортной средой для ПЦР (содержит консервант, предотвращающий деградацию ДНК).
  • Объем материала:Кровь – 3-5 мл (цельная) или 1-2 мл плазмы. Моча – 5-10 мл. Ликвор – 1-2 мл. Слюна – 1-2 мл. Амниотическая жидкость – 2-5 мл.
  • Обработка:Доставка в лабораторию осуществляется в день взятия (или в течение 12 часов при хранении при +2…+8°C). Замораживание допускается (при -20°C – до 1 месяца, при -70°C – до 1 года), но снижает выход ДНК. Стабильность ДНК в транспортной среде при комнатной температуре – до 21 дня (в зависимости от системы сбора).

 

Как подготовиться к анализу

Подготовка к анализу на ДНК ЦМВ зависит от типа клинического материала:

 

Кровь (для ПЦР):

• Голодание: не требуется. Кровь можно сдавать как натощак, так и после еды.
• Лекарства: Сообщить врачу о приеме противовирусных препаратов (ганцикловир, валганцикловир, фоскарнет, цидофовир, летермовир) – они снижают вирусную нагрузку и могут давать ложноотрицательный результат. Для мониторинга эффективности лечения анализ сдают до приема препарата (для определения минимального уровня).
• За 2-4 недели до анализа (по возможности) исключить прием иммуносупрессоров (циклоспорин, такролимус, метотрексат, азатиоприн, микофенолата мофетил, ритуксимаб) – они могут вызывать реактивацию ЦМВ.
• За 2-4 недели до анализа исключить прием антибиотиков (не влияют на вирус, но могут влиять на ПЦР-амплификацию? – нет, но важно для интерпретации).

 

Моча, слюна:

• Собирают утреннюю порцию (моча – средняя струя, слюна – после пробуждения, до чистки зубов, еды, питья).
• За 2-3 дня до сбора исключить прием уросептиков, антибактериальных препаратов (моча).
• Женщинам – не сдавать мочу во время менструации.

 

Амниотическая жидкость (беременные):

• Процедуру амниоцентеза проводит врач (акушер-гинеколог) по строгим показаниям (подозрение на врожденную ЦМВ-инфекцию). Анализ проводят не ранее 21-22 недель беременности и не ранее 6-8 недель после предполагаемой даты инфицирования матери (чтобы вирус успел попасть в амниотическую жидкость).
• Подготовка: по назначению врача.

 

Общие требования:

• За 2-4 недели до исследования (по возможности) исключить прием противовирусных препаратов (если цель – диагностика, а не мониторинг лечения).
• Сообщить врачу о наличии острых инфекционных заболеваний (лихорадка, ОРВИ, ангина) – они могут вызывать реактивацию ЦМВ (искажение результата).

 

Описание данного вещества (цитомегаловирус и метод ПЦР)

Цитомегаловирус (ЦМВ, Human herpesvirus type 5, HHV-5) – это ДНК-содержащий вирус из семейства Herpesviridae, подсемейства Betaherpesvirinae. Характеризуется медленной репликацией, выраженным цитомегалическим эффектом (увеличение инфицированных клеток, появление внутриядерных включений – «совиный глаз»), способностью к латентной персистенции в организме пожизненно (в моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках, клетках костного мозга, эпителии слюнных желез, почек) и реактивации при иммуносупрессии.

 

Эпидемиология:

• Серопревалентность (наличие IgG) в популяции: 40-80% (в развивающихся странах до 90-100%, в развитых – 50-70%). Первичное инфицирование обычно происходит в детстве (чаще бессимптомно) или подростковом/взрослом возрасте (чаще при половых контактах, через слюну, мочу, грудное молоко).
• Пути передачи: воздушно-капельный (слюна), половой (сперма, цервикальная слизь), контактный (моча, фекалии), трансплацентарный (от матери к плоду), при грудном вскармливании (через молоко), при переливании крови и трансплантации органов (от донора).

 

Клинические проявления:

 

Иммунокомпетентные взрослые и дети (первичная инфекция):

• Бессимптомно (90-95%).
• Мононуклеозоподобный синдром (5-10%): лихорадка, фарингит, лимфаденопатия (особенно шейная), гепатоспленомегалия, повышение АЛТ/АСТ, атипичные мононуклеары в крови (отличие от ВЭБ-инфекции – отрицательные антитела к ВЭБ). Может быть тяжелым у беременных (риск вертикальной передачи).

 

Иммунокомпрометированные пациенты (реактивация латентной инфекции или первичная инфекция):

• ВИЧ-инфекция (CD4 < 50-100):ЦМВ-ретинит (поражение сетчатки – «творожистый» ретинит, геморрагии, отслойка сетчатки, слепота), ЦМВ-колит (диарея, боли в животе, лихорадка, кровь в стуле), ЦМВ-эзофагит (дисфагия, одинофагия), ЦМВ-пневмония (одышка, гипоксия), ЦМВ-энцефалит (спутанность сознания, атаксия, слабоумие), ЦМВ-полирадикулопатия (слабость в ногах, недержание мочи), ЦМВ-адреналит (недостаточность надпочечников).
• Реципиенты трансплантатов (почки, печени, сердца, легких, костного мозга):ЦМВ-пневмония, ЦМВ-гепатит, ЦМВ-колит, ЦМВ-ретинит, ЦМВ-энцефалит, ЦМВ-панкреатит. ЦМВ-инфекция у реципиентов трансплантатов ассоциирована с повышенным риском отторжения трансплантата.
• Онкогематологические заболевания (лейкозы, лимфомы), после химиотерапии, лучевой терапии:ЦМВ-реактивация, пневмония, гепатит, колит, энцефалит.

 

Беременные (первичная ЦМВ-инфекция):

• Вертикальная передача плоду (трансплацентарно):Риск передачи – 30-40% при первичной инфекции в I триместре, 40-70% во II-III триместрах. Риск при реактивации – менее 1-2%.
• Врожденная ЦМВ-инфекция у новорожденных (10-15% инфицированных имеют симптомы):Микроцефалия, гидроцефалия, внутричерепные кальцификаты, хориоретинит, сенсоневральная тугоухость (глухота), гепатоспленомегалия, тромбоцитопения (петехиальная сыпь), задержка внутриутробного развития, желтуха, пневмония, энцефалит, судороги, летальность 10-20%. У 85-90% инфицированных новорожденных симптомы отсутствуют, но у 10-15% из них впоследствии развиваются отдаленные последствия (тугоухость, задержка психомоторного развития, хориоретинит).

 

Новорожденные и дети (перинатальная инфекция – при прохождении через инфицированные родовые пути, через грудное молоко):

• Чаще бессимптомно или легкое течение. У недоношенных – пневмония, гепатит, тромбоцитопения.

 

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция):

• Качественная ПЦР:Определяет наличие (обнаружено/не обнаружено) ДНК ЦМВ в образце. Не позволяет оценить вирусную нагрузку. Чувствительность метода – 10-100 копий ДНК в пробе. Специфичность – 98-100%. Используется для скрининга (например, у новорожденных, у доноров крови, у беременных с подозрением на первичную инфекцию).
• Количественная ПЦР (Real-Time PCR):Позволяет не только обнаружить ДНК ЦМВ, но и определить вирусную нагрузку (количество копий ДНК/мл или МЕ/мл – международные единицы, калиброванные по стандарту ВОЗ). Это критически важно для:

• Мониторинга ЦМВ-реактивации у иммунокомпрометированных пациентов (ВИЧ, трансплантация, онкогематология).
• Прогнозирования риска развития ЦМВ-болезни (чем выше вирусная нагрузка, тем выше риск).
• Оценки эффективности противовирусной терапии (снижение вирусной нагрузки в 1-2 log (10-100 раз) через 2-4 недели – благоприятный признак).
• Дифференциации активной инфекции (высокая нагрузка) от латентной (низкая нагрузка, или ДНК только в лейкоцитах, но не в плазме).
  • Мультиплексная ПЦР (сочетанное выявление нескольких возбудителей):Одновременное выявление ЦМВ, вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), герпесвируса 6 типа (HHV-6), герпесвируса 8 типа (HHV-8), аденовируса, парвовируса В19 (у иммунокомпрометированных).
  • Специфичность:Высокая (98-100%). Праймеры к консервативным участкам генома ЦМВ (например, к генам UL123 (IE1), UL83 (pp65), UL54 (ДНК-полимераза), UL55 (гликопротеин B), UL122 (IE2)) обеспечивают высокую специфичность.
  • Чувствительность:Очень высокая (90-100% для крови/плазмы при активной инфекции; 95-100% для мочи, слюны у новорожденных; 70-90% для амниотической жидкости). Чувствительность зависит от типа материала, стадии заболевания, приема противовирусных препаратов.

 

Диагностика заболеваний

Качественное (и количественное) определение ДНК цитомегаловируса используется для:

1. Диагностики активной ЦМВ-инфекции (виремии) у иммунокомпрометированных пациентов (ВИЧ-инфекция, реципиенты трансплантатов, онкогематологические заболевания):Это основное показание. Регулярный (еженедельный или ежемесячный) скрининг ЦМВ-ДНК в крови (количественная ПЦР) позволяет выявить реактивацию ЦМВ на доклинической стадии (до развития симптомов) и начать превентивную (профилактическую) противовирусную терапию (ганцикловир, валганцикловир, летермовир). Порог для начала превентивной терапии зависит от типа трансплантации и лаборатории (обычно > 1000-5000 копий/мл или > 1000-2000 МЕ/мл).
2. Мониторинга эффективности противовирусной терапии ЦМВ-инфекции:Количественная ПЦР крови (плазма) каждые 1-2 недели. Цель – снижение вирусной нагрузки в 1-2 log (10-100 раз) через 2-4 недели. Если вирусная нагрузка не снижается или растет – подозрение на устойчивость к препарату (требуется генотипирование – выявление мутаций в генах UL97 (устойчивость к ганцикловиру) и UL54 (устойчивость к ганцикловиру, цидофовиру, фоскарнету).
3. Диагностики врожденной ЦМВ-инфекции у новорожденных:ПЦР мочи или слюны (качественная или количественная) в первые 2-3 недели жизни (предпочтительно в первые 7-10 дней). Положительный результат подтверждает врожденную ЦМВ-инфекцию (вирус выделяется с мочой и слюной длительно). Отрицательный результат (в первые 2-3 недели) с высокой вероятностью исключает врожденную инфекцию. Важно: ПЦР крови у новорожденных менее чувствительна (40-60%), чем ПЦР мочи/слюны.
4. Пренатальной диагностики врожденной ЦМВ-инфекции (амниоцентез):ПЦР амниотической жидкости (количественная) – «золотой стандарт». Проводится не ранее 21-22 недель беременности и не ранее 6-8 недель после предполагаемой даты инфицирования матери. Высокая вирусная нагрузка (> 10^5-10^6 копий/мл) ассоциирована с высоким риском симптомной врожденной инфекции у плода.
5. Диагностики ЦМВ-энцефалита, менингита, миелита:ПЦР ликвора (качественная или количественная). Положительный результат (особенно в сочетании с ПЦР крови) подтверждает диагноз. Высокая вирусная нагрузка в ликворе (> 10^3-10^4 копий/мл) ассоциирована с плохим прогнозом.
6. Диагностики ЦМВ-пневмонии:ПЦР бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) или биоптата легкого. Сочетание с ПЦР крови (виремия) повышает специфичность.
7. Диагностики ЦМВ-колита, эзофагита, гастрита, гепатита:ПЦР биоптатов кишечника, пищевода, желудка, печени (гистологическое исследование + ПЦР). ПЦР крови часто положительна.
8. Диагностики ЦМВ-ретинита:Диагноз ставится на основании офтальмоскопии (характерные изменения сетчатки). ПЦР стекловидного тела (влага глаза) подтверждает диагноз (но инвазивно, редко). ПЦР крови часто положительна.
9. Скрининга доноров крови, органов, тканей:Качественная ПЦР крови (или ПЦР лейкоцитов) для исключения активной ЦМВ-инфекции у донора (особенно для реципиентов-иммунокомпрометированных). Положительный результат – противопоказание к донации.
10. Обследования беременных с подозрением на первичную ЦМВ-инфекцию:ПЦР крови, мочи, слюны (качественная или количественная) в комплексе с серологией (IgM, IgG, авидность IgG). Положительная ПЦР крови при первичной инфекции (особенно в I триместре) – высокий риск вертикальной передачи. Отрицательная ПЦР не исключает первичную инфекцию (виремия может быть кратковременной).

 

Цель исследования

Основные цели качественного (и количественного) определения ДНК цитомегаловируса:

1. Диагностика активной ЦМВ-инфекции (виремии) у иммунокомпрометированных пациентов (ВИЧ, трансплантация, онкогематология).
2. Мониторинг ЦМВ-реактивации и превентивная терапияу реципиентов трансплантатов (регулярная количественная ПЦР крови).
3. Мониторинг эффективности противовирусной терапии(количественная ПЦР крови в динамике).
4. Диагностика врожденной ЦМВ-инфекции(ПЦР мочи/слюны новорожденного в первые 2-3 недели жизни).
5. Пренатальная диагностика врожденной ЦМВ-инфекции(ПЦР амниотической жидкости).
6. Диагностика ЦМВ-энцефалита, менингита, миелита(ПЦР ликвора).
7. Диагностика ЦМВ-пневмонии, колита, эзофагита, гепатита, ретинита(ПЦР соответствующих биоптатов/жидкостей).
8. Скрининг доноров крови, органов, тканей.
9. Обследование беременных с подозрением на первичную ЦМВ-инфекцию(в комплексе с серологией).

 

Что значат полученные результаты

Интерпретация результатов определения ДНК ЦМВ всегда проводится врачом-инфекционистом, гематологом, трансфузиологом, неонатологом, акушером-гинекологом в контексте клинической картины, иммунного статуса пациента (CD4, тип трансплантации, фаза после трансплантации, наличие иммуносупрессии), а также с учетом динамики вирусной нагрузки (при количественной ПЦР). Референсное значение – «не обнаружено» (для качественной ПЦР) или менее 100-200 копий/мл (нижний предел количественного определения).

 

Референсные значения (качественная ПЦР):

• Отрицательный результат («не обнаружено»):ДНК ЦМВ в исследуемом образце не обнаружена (или концентрация ниже предела чувствительности, < 10-100 копий/мл). Активная ЦМВ-инфекция маловероятна. Однако у иммунокомпрометированных пациентов возможна ложноотрицательная ПЦР (вирус находится только в тканях, не в крови, или вирусная нагрузка ниже предела чувствительности). Рекомендуется повторное исследование через 1-2 недели.
• Положительный результат («обнаружено»):ДНК ЦМВ обнаружена. Указывает на наличие ЦМВ в организме. Клиническое значение зависит от:

• Клинического контекста (иммунокомпетентный vs иммунокомпрометированный).
• Количества ДНК (вирусной нагрузки).
• Типа материала (кровь/плазма vs моча/слюна).
• Динамики (нарастание или снижение).

 

Количественная ПЦР (Real-Time PCR, вирусная нагрузка в копиях/мл или МЕ/мл – международные единицы):

Важно: Разные тест-системы имеют разные пороговые значения. Приводимые цифры – ориентировочные. Всегда используйте референсы вашей лаборатории!

• < 100-500 копий/мл (или МЕ/мл) – низкая вирусная нагрузка:У иммунокомпетентных – может быть транзиторная виремия (при первичной инфекции), обычно бессимптомно. Лечение не требуется. У иммунокомпрометированных – ранняя стадия реактивации, или низкий уровень персистенции. Требует динамического контроля (повтор через 1-2 недели). У новорожденных (моча/слюна) – врожденная инфекция, но низкая нагрузка.
• 500 – 5000 копий/мл – умеренная вирусная нагрузка:У иммунокомпрометированных – активная реактивация. Риск развития ЦМВ-болезни (пневмония, колит, ретинит, энцефалит) умеренный. Показана превентивная терапия (ганцикловир, валганцикловир) для реципиентов трансплантатов (особенно при нарастании нагрузки). У иммунокомпетентных – первичная инфекция (часто бессимптомно или мононуклеозоподобный синдром).
• > 5000-10000 копий/мл – высокая вирусная нагрузка:У иммунокомпрометированных – высокий риск ЦМВ-болезни. Показана противовирусная терапия. У ВИЧ-инфицированных с CD4 < 50 – высокий риск ретинита, колита, энцефалита. У новорожденных (кровь) – высокая нагрузка ассоциирована с симптомной врожденной инфекцией.
• > 100000 копий/мл – очень высокая вирусная нагрузка:У иммунокомпрометированных – ЦМВ-болезнь с высокой вероятностью. Требует немедленной противовирусной терапии (внутривенный ганцикловир, фоскарнет, летермовир). У ВИЧ-инфицированных с CD4 < 50 – почти всегда ЦМВ-ретинит, колит, энцефалит.

 

Динамика (нарастание или снижение):

• Нарастание вирусной нагрузки (в 2-4 раза и более за 1-2 недели):Неблагоприятный прогноз, активная репликация вируса, высокий риск ЦМВ-болезни. Требует усиления терапии (или начала терапии).
• Снижение вирусной нагрузки (в 1-2 log, т.е. 10-100 раз за 2-4 недели):Благоприятный прогноз, ответ на противовирусную терапию.
• Отсутствие снижения или рост на фоне терапии:Подозрение на устойчивость к препарату (требуется генотипирование – мутации UL97 и UL54).

 

Интерпретация в зависимости от клинической ситуации:

 

Иммунокомпрометированный пациент (реципиент трансплантата, ВИЧ с CD4 < 100, онкогематология) + положительная ПЦР крови (любая нагрузка):

• Интерпретация:ЦМВ-реактивация. Требует мониторинга (количественная ПЦР каждые 1-2 недели). При нарастании нагрузки или появлении симптомов – противовирусная терапия. При нагрузке > 1000-5000 копий/мл – превентивная терапия (по протоколам).

 

ВИЧ-инфицированный с CD4 < 50 + положительная ПЦР крови (> 1000 копий/мл) + симптомы (снижение зрения, диарея, одышка, лихорадка):

• Интерпретация:ЦМВ-ретинит, колит, пневмония, энцефалит. Требует немедленной противовирусной терапии (ганцикловир, фоскарнет, летермовир) + антиретровирусная терапия (АРТ).

 

Новорожденный (возраст до 2-3 недель) + положительная ПЦР мочи или слюны:

• Интерпретация:Врожденная ЦМВ-инфекция. Требует клинического обследования (невролог, офтальмолог, аудиолог), УЗИ головного мозга (кальцификаты), офтальмоскопии (хориоретинит), аудиологического скрининга (тугоухость). При симптомной инфекции (микроцефалия, гепатоспленомегалия, тромбоцитопения, пневмония, энцефалит) – противовирусная терапия (валганцикловир, ганцикловир). При бессимптомной – наблюдение (риск поздней тугоухости).

 

Новорожденный (возраст > 3 недель) + положительная ПЦР мочи или слюны:

• Интерпретация:Может быть врожденной инфекцией (если инфицирование произошло внутриутробно) или перинатальной/постнатальной (при родах, через грудное молоко). Для дифференциации: ПЦР крови (при перинатальной/постнатальной инфекции виремия кратковременная, у иммунокомпетентных детей редко). Лечение только при симптомах (пневмония, гепатит, энцефалит – у недоношенных, у детей с иммунодефицитом).

 

Беременная (I триместр) + положительная ПЦР крови (виремия) + IgM положительный, авидность IgG низкая:

• Интерпретация:Первичная ЦМВ-инфекция. Высокий риск вертикальной передачи (30-40%). Требует амниоцентеза (ПЦР амниотической жидкости) не ранее 21-22 недель. При подтверждении врожденной инфекции у плода – обсуждение пролонгирования беременности (лечение во время беременности не рекомендуется, но в некоторых странах используется валганцикловир или гипериммунный иммуноглобулин – данные противоречивы).

 

Беременная (II-III триместр) + положительная ПЦР крови (низкая нагрузка) + IgM отрицательный, IgG положительный (высокая авидность):

• Интерпретация:Реактивация латентной ЦМВ-инфекции. Риск вертикальной передачи минимален (< 1-2%). Амниоцентез обычно не требуется. Наблюдение.

 

Иммунокомпетентный взрослый + положительная ПЦР крови (низкая нагрузка) + симптомы (лихорадка, фарингит, лимфаденопатия):

• Интерпретация:Мононуклеозоподобный синдром, вызванный ЦМВ (первичная инфекция). Лечение симптоматическое (противовирусные – только при тяжелом течении, например, при пневмонии, энцефалите).

 

Иммунокомпетентный взрослый + положительная ПЦР мочи (или слюны) + отрицательная ПЦР крови:

• Интерпретация:Латентная ЦМВ-инфекция с периодическим выделением вируса (транзиторная вирурия). Не требует лечения.

 

Важные нюансы интерпретации:

• ПЦР плазмы (свободный вирус) vs ПЦР цельной крови (вирус в лейкоцитах):Плазма отражает активную репликацию (виремию). Цельная кровь более чувствительна, но может давать положительный результат при латентной инфекции (вирус в лейкоцитах без репликации). Для мониторинга реакции на терапию предпочтительнее плазма.
• Единицы измерения: копии/мл vs МЕ/мл (международные единицы):МЕ/мл калиброваны по стандарту ВОЗ (первый международный стандарт ЦМВ, код 09/162). Разные тест-системы могут давать разные абсолютные значения (в 2-5 раз). При мониторинге важно использовать одну и ту же тест-систему (для сравнения результатов в динамике).
• Ложноположительный результат:Возможен при контаминации образца (несоблюдение правил асептики, загрязнение реагентов). Частота ложноположительных результатов в хорошо организованных лабораториях составляет менее 0,5-1%.
• Ложноотрицательный результат:Возможен при неправильном взятии материала (недостаточное количество крови, мочи), при длительном хранении (деградация ДНК), при подавлении ПЦР (ингибиторы в образце – гепарин, гемоглобин, мочевая кислота), при очень низкой вирусной нагрузке (ниже предела чувствительности), при приеме противовирусных препаратов до анализа.
• Контроль излеченности:Для иммунокомпрометированных пациентов – отрицательная ПЦР плазмы (или снижение до < 100-500 копий/мл) через 2-4 недели после окончания курса противовирусной терапии.

 

Факторы, влияющие на результат

На результат определения ДНК цитомегаловируса могут влиять различные преаналитические, аналитические и биологические факторы:

 

Преаналитические (до взятия материала):

• Прием противовирусных препаратов (ганцикловир, валганцикловир, фоскарнет, цидофовир, летермовир)за 2-4 недели до анализа – приводит к ложноотрицательным результатам (снижение вирусной нагрузки, разрушение ДНК). Это самый частый фактор ложноотрицательных результатов.
• Прием иммуносупрессоров (циклоспорин, такролимус, метотрексат, азатиоприн, микофенолата мофетил, ритуксимаб, глюкокортикоиды)– может вызывать реактивацию ЦМВ (увеличение вирусной нагрузки). Важно для интерпретации (реактивация на фоне иммуносупрессии – ожидаемое явление).
• Гепарин(в пробирках с зеленой крышкой) – ингибирует ПЦР (ложноотрицательный результат). Используйте пробирки с ЭДТА (фиолетовая) или цитратом (синяя).
• Длительное хранение крови при комнатной температуре(более 2-4 часов) – деградация ДНК (ложноотрицательный результат). Центрифугируйте в течение 2 часов.
• Замораживание-оттаивание(более 1-2 циклов) – деградация ДНК.
• Гемолиз, липемия образца– ингибиторы ПЦР (ложноотрицательный результат).

 

Аналитические (на этапе лабораторного исследования):

• Контаминация реагентов и лабораторной посудыампликонами (продуктами ПЦР) – ложноположительный результат.
• Ингибиторы ПЦРв образце (гепарин, гемоглобин, мочевая кислота, препараты для местного лечения) – ложноотрицательный результат.
• Нарушение температурного режима хранения транспортной среды(замораживание, перегрев) – деградация ДНК.
• Чувствительность тест-системы:Разные коммерческие наборы имеют разную чувствительность (10-100 копий/мл). Высокочувствительные тесты предпочтительнее для иммунокомпрометированных пациентов.
• Калибровка по стандарту ВОЗ:Для количественной ПЦР результаты в МЕ/мл должны быть калиброваны по стандарту ВОЗ (для сопоставимости между лабораториями).

 

Биологические факторы:

• Иммунный статус (CD4-лимфоциты):У ВИЧ-инфицированных с CD4 < 50-100 риск реактивации ЦМВ и ЦМВ-болезни значительно выше. Положительная ПЦР крови (даже с низкой нагрузкой) у таких пациентов требует активного наблюдения.
• Тип трансплантации:У реципиентов аллогенных трансплантатов костного мозга риск ЦМВ-реактивации выше (50-70%), чем у реципиентов аутологичных (10-20%). У реципиентов солидных органов (почки, печень, сердце) – 20-40%.
• Стадия после трансплантации:Риск реактивации максимален через 1-6 месяцев после трансплантации (до восстановления иммунитета).
• Беременность:Иммуносупрессия может вызывать реактивацию ЦМВ (редко, риск вертикальной передачи при реактивации < 1-2%).
• Возраст:У новорожденных и детей раннего возраста ЦМВ-инфекция может протекать тяжелее (пневмония, гепатит, энцефалит). У пожилых – риск реактивации ниже.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

---

Список литературы:

1. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Цитомегаловирусная инфекция у взрослых». 2021.
2. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Цитомегаловирусная инфекция у детей». 2021.
3. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «ВИЧ-инфекция у взрослых (оппортунистические инфекции)». 2020.
4. Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (профилактика и лечение ЦМВ-инфекции)». 2020.
5. Ljungman P., de la Camara R., Robin C. et al. Guidelines for the management of cytomegalovirus infection in patients with haematological malignancies and after stem cell transplantation from the 2017 European Conference on Infections in Leukaemia (ECIL 7). The Lancet Infectious Diseases. 2019;19(8):e260-e272.

 

Тромбофилия (мутации по 8 генам) – ПЦР генетика

 

Краткая История

Тромбофилия – это состояние повышенной склонности организма к тромбообразованию, которое может быть как наследственным, так и приобретенным . Изучение генетических факторов тромбофилии началось в середине XX века, когда были описаны первые случаи дефицита антитромбина, протеина С и протеина S. Однако настоящий прорыв произошел в 1990-х годах. В 1993 году была открыта мутация фактора V Leiden (F5: 1691 G>A), которая оказалась наиболее частой причиной наследственной тромбофилии у лиц европейского происхождения . В 1996 году была описана мутация гена протромбина (F2: 20210 G>A), также значительно повышающая риск венозных тромбозов . В последующие годы с развитием молекулярно-генетических методов (полимеразная цепная реакция в реальном времени – Real-Time PCR) стало возможным быстрое и точное выявление не только этих двух основных мутаций, но и полиморфизмов других генов системы гемостаза: фибриногена (FGB), фактора VII (F7), фактора XIII (F13A1), ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1/SERPINE1), а также тромбоцитарных рецепторов ITGA2 и ITGB3 . Сегодня исследование методом ПЦР восьми наиболее значимых генетических маркеров тромбофилии является важным инструментом для оценки риска тромботических осложнений, планирования беременности, выбора тактики гормональной терапии и профилактики тромбозов у пациентов с отягощенным анамнезом.

 

Материал, используемый для исследования

• • Тип образца:Венозная кровь.
  • Тип пробирки:Вакуумная пробирка с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Используются пробирки с К3-ЭДТА (крышечка фиолетового или сиреневого цвета) .
  • Объем:Обычно 3-5 мл крови.
  • Обработка:После взятия кровь аккуратно перемешивается (переворачивается) для равномерного смешивания с антикоагулянтом. Замораживание образца не требуется. Доставка в лабораторию осуществляется при комнатной температуре. Стабильность ДНК в цельной крови с ЭДТА при +4°C составляет несколько недель, при -20°C – несколько месяцев.

 

Как подготовиться к анализу

Подготовка к генетическому исследованию тромбофилии относительно проста, но требует соблюдения стандартных правил для исключения влияния внешних факторов:

• Голодание:Рекомендуется сдавать кровь натощак, после 8-12 часов ночного голодания. Разрешена чистая негазированная вода .
• Физическая нагрузка:Избегать интенсивных физических нагрузок (бег, подъем по лестнице, подъем тяжестей) за 24 часа до исследования .
• Тепловые процедуры:Исключить посещение бани, сауны за 24 часа до анализа .
• Алкоголь:Исключить употребление алкоголя за 1-2 дня до исследования .
• Курение:Не курить в течение 30-60 минут до сдачи крови .
• Эмоциональное состояние:Перед забором крови следует отдохнуть 10-15 минут, успокоиться .
• Лекарственные препараты:Генетическое исследование не зависит от приема лекарств (генотип не меняется). Однако, если пациент принимает антикоагулянты (варфарин, ривароксабан, апиксабан, дабигатран, гепарин) или антиагреганты (аспирин, клопидогрел), это важно для интерпретации клинического контекста, но не влияет на результат ПЦР .
• Инфекционные заболевания:Острые инфекционные заболевания не влияют на результат генотипирования, так как ДНК остается неизменной.

 

Описание данного вещества

Тромбофилия – это патологическое состояние, характеризующееся повышенной склонностью к образованию тромбов (кровяных сгустков) в кровеносных сосудах. Это может приводить к венозным тромбозам (тромбоз глубоких вен нижних конечностей), тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА), а в некоторых случаях – к артериальным тромбозам (инфаркт миокарда, ишемический инсульт) . Тромбофилия может быть наследственной (обусловлена генетическими мутациями) и приобретенной (например, антифосфолипидный синдром, онкологические заболевания, длительная иммобилизация, беременность, прием гормональных контрацептивов) .

 

Метод ПЦР генетика (полимеразная цепная реакция для генотипирования):

• Суть метода:Выделение ДНК из лейкоцитов крови, последующая амплификация (многократное копирование) специфических участков генов, кодирующих факторы свертывания крови и фибринолиза, и анализ наличия точечных мутаций (однонуклеотидных полиморфизмов, SNP). Исследование проводится методом ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) с анализом кривых плавления или с использованием флуоресцентно-меченых зондов (TaqMan) .
• Исследуемые гены (8 точек):Панель включает полиморфизмы генов, связанных с плазменным звеном гемостаза (факторы свертывания и фибринолиза) и тромбоцитарным звеном (рецепторы тромбоцитов) .

 

4.1. Гены плазменного звена гемостаза

1. F5 (фактор V, Лейденская мутация) – 1691 G>A:Наиболее частая причина наследственной тромбофилии у лиц европейского происхождения. Мутация приводит к замене аргинина на глутамин в позиции 506 фактора V, что делает его устойчивым к расщеплению активированным протеином С (APC-резистентность). В результате фактор V остается активным дольше, что усиливает свертывание крови . Гомозиготное носительство (А/А) значительно повышает риск тромбозов, гетерозиготное (G/A) – умеренно.
2. F2 (протромбин, фактор II) – 20210 G>A:Мутация в 3′-нетранслируемой области гена протромбина приводит к повышению его концентрации в плазме на 20-30% . Это увеличивает образование тромбина и, следовательно, риск венозных тромбозов. Является второй по частоте наследственной тромбофилией.
3. FGB (фибриноген, фактор I) – -455 G>A:Полиморфизм в промоторной области гена β-цепи фибриногена. Вариант А ассоциирован с повышением уровня фибриногена в плазме на 10-30% . Фибриноген является ключевым белком в образовании тромба, его повышение увеличивает вязкость крови и риск тромбообразования, а также является фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний.
4. F7 (фактор VII) – 10976 G>A (или -402 G>A):Полиморфизм в промоторной области гена фактора VII. Вариант А ассоциирован с более низким уровнем фактора VII. Это может повышать риск кровотечений на фоне антикоагулянтной терапии (например, варфарином) или, наоборот, иметь некоторый протективный эффект в отношении тромбозов, однако клиническое значение полиморфизма остается предметом дискуссий .
5. F13A1 (фактор XIII) – G>T (или G>A):Фактор XIII стабилизирует фибриновый сгусток, сшивая цепи фибрина. Полиморфизм в гене A-субъединицы фактора XIII (чаще всего Val34Leu) может изменять активность фермента и структуру сгустка, влияя на риск тромбозов и геморрагических осложнений .
6. SERPINE 1 (PAI-1, ингибитор активатора плазминогена 1) – 675 5G>4A:Полиморфизм в промоторной области гена PAI-1. Вариант 4G/4G связан с повышенной транскрипцией и, следовательно, с повышенным уровнем PAI-1 в крови . PAI-1 является основным ингибитором тканевого активатора плазминогена (t-PA) и урокиназы, что приводит к снижению фибринолитической активности (растворения тромбов). Это повышает риск тромбозов, особенно в сочетании с другими мутациями. Вариант 4G/4G также ассоциирован с неблагоприятным исходом при сепсисе и с ожирением.

 

4.2. Гены тромбоцитарного звена гемостаза

7. ITGA2 (интегрин α2, GP Ia, тромбоцитарный рецептор к коллагену) – 807 C>T:Кодирует α2-субъединицу интегрина α2β1 (GP Ia/IIa) – основного рецептора тромбоцитов к коллагену. Полиморфизм 807 C>T (синонимичная замена F224F) влияет на плотность рецепторов на поверхности тромбоцитов. Вариант Т ассоциирован с более высокой экспрессией рецептора и, следовательно, с повышенной адгезией тромбоцитов к коллагену в месте повреждения сосудистой стенки, что увеличивает риск артериальных и венозных тромбозов .
8. ITGB3 (интегрин β3, GP IIIa, тромбоцитарный рецептор к фибриногену) – 1565 T>C (L33P):Кодирует β3-субъединицу интегрина αIIbβ3 (GP IIb/IIIa) – ключевого рецептора для фибриногена и фактора фон Виллебранда, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов (сшивание тромбоцитов между собой). Полиморфизм 1565 T>C (Leu33Pro) влияет на конформацию рецептора. Вариант С (Pro33) ассоциирован с повышенной агрегацией тромбоцитов и повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда и ишемического инсульта .

 

Диагностика заболеваний

Генетическое исследование тромбофилии (мутации по 8 генам) используется для:

• Оценки наследственной предрасположенности к тромбозам:У пациентов, перенесших венозный тромбоз (тромбоз глубоких вен, ТЭЛА) или артериальный тромбоз (инфаркт, инсульт) в молодом возрасте (до 50 лет) .
• Скрининга в группах риска:При планировании беременности, перед экстракорпоральным оплодотворением (ЭКО), перед назначением гормональных контрацептивов (КОК) или заместительной гормональной терапии (ЗГТ) у женщин с отягощенным анамнезом .
• Обследования при привычном невынашивании беременности, замершей беременности, тяжелых гестозах (преэклампсия), отслойке плаценты, задержке внутриутробного развития плода:Тромбофилия является одной из частых причин этих осложнений.
• Обследования родственников пациентов с подтвержденными наследственными тромбофилиями (F2, F5) для выявления лиц, нуждающихся в профилактике .
• Планирования антикоагулянтной терапии:Носительство некоторых мутаций (например, F7) может влиять на чувствительность к варфарину и риск кровотечений .
• Прогнозирования риска тромботических осложнений после хирургических вмешательств, травм, длительной иммобилизации .

 

Цель исследования

Основные цели генетического анализа тромбофилии (8 генов):

1. Выявление генетических факторов рискатромбообразования (наследственная тромбофилия).
2. Стратификация рискавенозных и артериальных тромбозов у пациентов с отягощенным анамнезом.
3. Профилактика тромботических осложненийпри планировании беременности, ЭКО, назначении гормональных препаратов, перед хирургическими вмешательствами.
4. Выявление причин привычного невынашивания беременностии тяжелых акушерских осложнений.
5. Обследование родственниковпациентов с наследственной тромбофилией (F2, F5) для индивидуального подхода к профилактике.
6. Подбор оптимальной антикоагулянтной и антитромбоцитарной терапии(оценка риска кровотечений на фоне лечения).

 

Что значат полученные результаты

Интерпретация результатов генетического исследования тромбофилии всегда проводится врачом-гематологом, генетиком, акушером-гинекологом или терапевтом в контексте клинической картины, семейного анамнеза и других факторов риска. Результат выдается в качественном формате: для каждого полиморфизма указывается генотип («норма» – без мутации, «гетерозигота» – одна мутантная копия, «гомозигота» – две мутантные копии) .

 

7.1. Нормальные значения (отсутствие мутаций):

• Для каждого из 8 исследуемых генов результат «норма» или «не обнаружено» означает, что у пациента нет исследуемой мутации в гомозиготном или гетерозиготном состоянии. Однако это не исключает наличия других, не входящих в панель генетических факторов тромбофилии или приобретенных форм (антифосфолипидный синдром, дефицит протеина С, протеина S, антитромбина) .

 

7.2. Повышенные значения (наличие мутаций):

 

F5 1691 G>A (Лейденская мутация):

• Гетерозигота (G/A):Умеренное повышение риска венозных тромбозов (в 3-8 раз). Распространенность в популяции 2-5%.
• Гомозигота (A/A):Значительное повышение риска венозных тромбозов (в 50-100 раз). Встречается редко (менее 1%).
• Клиническое значение:Повышен риск тромбозов глубоких вен, ТЭЛА, особенно на фоне беременности, приема КОК, травм, операций .

 

F2 20210 G>A (мутация протромбина):

• Гетерозигота (G/A):Повышение риска венозных тромбозов в 2-4 раза. Распространенность 1-2%.
• Гомозигота (A/A):Значительное повышение риска (встречается крайне редко).
• Клиническое значение:Повышен риск тромбозов глубоких вен, ТЭЛА, а также акушерских осложнений.

 

FGB -455 G>A (фибриноген):

• Гетерозигота (G/A) или гомозигота (A/A):Повышение уровня фибриногена в крови на 10-30%, что увеличивает вязкость крови и риск тромбозов, а также ассоциировано с риском атеросклероза .

 

F7 10976 G>A (фактор VII):

• Гомозигота (A/A):Более низкий уровень фактора VII. Может повышать риск кровотечений на фоне антикоагулянтной терапии. Клиническое значение требует дальнейшего изучения .

 

F13A1 G>T (фактор XIII):

• Вариант Т:Может влиять на структуру фибринового сгустка. Ассоциация с риском тромбозов неоднозначна, некоторые исследования указывают на протективный эффект, другие – на повышение риска геморрагических осложнений .

 

SERPINE1 675 5G>4A (PAI-1):

• Гетерозигота (5G/4G):Умеренное повышение уровня PAI-1, умеренное снижение фибринолитической активности.
• Гомозигота (4G/4G):Значительное повышение уровня PAI-1, снижение фибринолиза, повышение риска тромбозов (особенно в сочетании с другими мутациями), а также неблагоприятный прогноз при сепсисе и ожирении .

 

ITGA2 807 C>T (GP Ia, рецептор к коллагену):

• Гетерозигота (C/T) или гомозигота (T/T):Повышение плотности рецепторов на тромбоцитах, усиление адгезии тромбоцитов к коллагену, повышение риска артериальных тромбозов (инфаркт, инсульт) .

 

ITGB3 1565 T>C (GP IIIa, рецептор к фибриногену):

• Гетерозигота (T/C) или гомозигота (C/C):Усиление агрегации тромбоцитов (фенотип «гипертромбоцитарный»), повышение риска сердечно-сосудистых заболеваний, инфаркта миокарда, инсульта .

 

Важные нюансы интерпретации:

• Комбинация мутаций:Наличие двух и более мутаций (например, F5 и F2; F5 и PAI-1 4G/4G) значительно синергически повышает риск тромбозов, особенно венозных.
• Клинический контекст:Генетическая предрасположенность не всегда реализуется в тромбоз. Решающее значение имеют дополнительные факторы риска: хирургические вмешательства, травмы, иммобилизация, беременность, прием КОК, ожирение, курение, онкологические заболевания .
• Наследственные vs приобретенные формы:Генетическая панель не выявляет приобретенные тромбофилии (антифосфолипидный синдром, дефицит протеина С, протеина S, антитромбина). При отрицательном результате, но высокой клинической вероятности, показано расширенное обследование .
• Прогностическая ценность:Для большинства полиморфизмов (кроме F2 и F5) доказательная база неоднозначна. Результаты следует интерпретировать с осторожностью, в комплексе с другими клиническими данными.

 

Факторы, влияющие на результат

Генетическое исследование (генотипирование) является наиболее точным из лабораторных методов, так как ДНК не изменяется под влиянием внешних факторов. Однако возможны:

• Преаналитические ошибки:Неправильное взятие крови (гемолиз), использование неправильной пробирки (с другим антикоагулянтом), недостаточное количество биоматериала могут привести к невозможности выделения ДНК.
• Технические ошибки:Контаминация реагентов, нарушение температурного режима ПЦР.
• Биологические факторы:Недавняя гемотрансфузия (переливание крови) может исказить результат (будет определена ДНК донора). Рекомендуется проводить исследование до переливания крови или через несколько месяцев после него.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

---

Список литературы:

1. РКБ им. Н.А. Семашко. Кардиогенетика: тромбофилия (8 точек) ПЦР.
2. Клиника «Евромед». Анализ крови с ЭДТА на КардиоГенетику. Тромбофилия (8 точек) методом ПЦР.
3. MSD Справочник (версия для потребителей). Избыточное свертывание (тромбофилия).
4. Пакет №191.4 (ПЦР. Генетика. Тромбофилия. Скрининг).
5. Thrombophilia Susceptibility Real-Time PCR Genotyping Kit (8 SNPs).
6. Инвитро. Подготовка к операции (генетические факторы риска тромбоэмболии).
7. American Society of Hematology. You Make the Call: Elevated Factor Levels Post-Stroke. ASH Clinical News. July 2025.

1. Краткая История
   Исследование микробиоты человека долгое время фокусировалось на кишечнике и женском урогенитальном тракте. Мужская урогенитальная микробиота считалась стерильной или бедной, пока развитие молекулярных методов, особенно ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)и высокопроизводительного секвенирования (NGS), не позволило выявить сложное микробное сообщество. Анализ «Андрофлор»был разработан российскими учеными (компания «ДНК-Технология») в начале 2010-х годов как адаптация успешной женской панели «Фемофлор». Он стал первым коммерчески доступным комплексным ПЦР-тестом, направленным на количественную оценку нормо- и условно-патогенной микрофлоры, а также абсолютных патогенов мужской уретры. «Андрофлор-Скрин» представляет собой его скрининговую версию, охватывающую ключевые микроорганизмы для быстрой оценки состояния микробиоты.
2. Материал, используемый для исследования

• Основной материал: Первая порция утренней мочи (15-20 мл) ИЛИ Соскоб из уретры.
• Предпочтение: Первая порция утренней мочи является предпочтительным и менее инвазивным материалом для «Андрофлор-Скрин». Она собирает десквамированные эпителиальные клетки и микрофлору из уретры при мочеиспускании.
• Тип контейнера:
  • Для мочи: Стерильный пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой (объем 30-60 мл).
  • Для соскоба: Специальная стерильная зонд-щетка (урогенитальный зонд типа U) в транспортной среде (обычно на основе фосфатно-солевого буфера с добавками, предотвращающими деградацию ДНК, например, типа «Эппендорф» с жидкой средой).
• Важно: Использовать только специализированные наборы для забора, предоставляемые лабораторией или соответствующие ее требованиям. Стандартные контейнеры для общего анализа мочи не подходят.

3. Как подготовиться к анализу
   Подготовка критически важна для достоверности:

• Половое воздержание: Исключить половые контакты за 24-48 часов до забора материала.
• Гигиена: Утром в день сдачи, перед забором материала, провести туалет наружных половых органов теплой водой с мылом (без антисептиков!), тщательно смыть мыло и высушить чистым полотенцем. Не использовать антибактериальное мыло или растворы!
• Мочеиспускание: Если берется моча: Не мочиться минимум 1.5-3 часа до сбора первой порции. Собрать строго первую порцию утренней мочи (первые 15-20 мл струи) в стерильный контейнер. Собрать нужно именно в момент начала мочеиспускания. Последующие порции мочи не информативны! Если берется соскоб: Мочеиспускание должно быть не менее чем за 1.5-2 часа до забора материала.
• Лекарственные препараты:
  • Антибиотики и антимикотики: Прекратить прием не менее чем за 14-30 дней до исследования. Эти препараты значительно искажают картину микробиоты.
  • Уросептики: Отменить за 3-5 дней.
  • Местные препараты (мази, растворы): Не применять в области уретры за 2-3 дня.
  • Противовирусные: Могут влиять на обнаружение вирусов (если они входят в панель). Согласовать с врачом.
• Физиотерапия и инстилляции: Исключить любые манипуляции на уретре (инстилляции, массаж простаты, физио) за 3-5 дней до исследования.
• Сроки после инструментальных вмешательств: После цистоскопии, катетеризации, бужирования должно пройти не менее 7-10 дней.
• Транспортировка: Доставить материал в лабораторию в течение 1-2 часов при комнатной температуре или при +2…+8°С (в холодильнике). Если используется транспортная среда для соскобов, уточнить ее стабильность. Замораживание не допускается.

4. Описание метода и параметров
   «Андрофлор-Скрин» – это мультиплексное ПЦР-исследование в реальном времени (ПЦР-РВ)с детекцией результатов методом флуоресцентной гибридизации (FAM, RОХ и др. каналы). Он позволяет:

1. Количественно определить общую бактериальную массу (ОБМ) – ключевой показатель адекватности материала и уровня микробной обсемененности.
2. Количественно оценить основные группы/виды микроорганизмов, составляющих нормоценоз и часто вызывающих дисбиоз:
   • Lactobacillus spp. (Лактобациллы) – ключевые представители нормофлоры, поддерживающие защитный барьер.
   • Staphylococcus spp. (Стафилококки)
   • Streptococcus spp. (Стрептококки)
   • Enterobacteriaceae (Энтеробактерии: кишечная палочка, клебсиеллы, протей и др.)
   • Enterococcus spp. (Энтерококки)
   • Corynebacterium spp. (Коринебактерии)
   • Gardnerella vaginalis (Гарднерелла вагиналис)
   • Ureaplasma urealyticum + Ureaplasma parvum (Уреаплазмы)
   • Mycoplasma hominis (Микоплазма хоминис)
   • Candida spp. (Дрожжеподобные грибы рода Кандида)
3. Качественно (обнаружить ДНК) выявить абсолютные патогены:
   • Neisseria gonorrhoeae (Гонококк, возбудитель гонореи)
   • Trichomonas vaginalis (Трихомонада, возбудитель трихомониаза)
   • Mycoplasma genitalium (Микоплазма гениталиум)
   • Chlamydia trachomatis (Хламидия трахоматис)
4. Рассчитать Относительные концентрации (ОК) для условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) как процент от ОБМ.
5. Рассчитать Дисбиотический индекс (ДИ) – интегральный показатель состояния микробиоты уретры.

5. Диагностика заболеваний
   «Андрофлор-Скрин» предназначен для диагностики:

• Уретрита (включая негонококковый/нехламидийный — НГУ/НХУ): Выявление дисбиоза и условно-патогенных возбудителей как причины воспаления.
• Хронического простатита/синдрома хронической тазовой боли (ХП/СХТБ): Оценка роли уретральной и, косвенно, простатической микробиоты в патогенезе. Особенно актуально при категориях IIIА/IIIБ по NIH.
• Бактериального цистита: Выявление уропатогенов, мигрирующих из уретры.
• Бессимптомной бактериурии/уретроносительства: Количественная оценка носительства УПМ.
• Мужского бесплодия: Исследование связи дисбиоза уретры с качеством спермы и воспалением в репродуктивном тракте.
• Контроля эффективности антибактериальной терапии: Оценка динамики микробного пейзажа.
• Скрининга на ИППП (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium): Особенно при наличии жалоб или рисков.

6. Цель исследования
   Основные цели назначения «Андрофлор-Скрин»:

1. Комплексная оценка состояния микробиоты уретры: Определение соотношения нормофлоры (лактобациллы) и УПМ.
2. Диагностика дисбиоза (дисбактериоза) уретры: Выявление количественного и качественного дисбаланса микрофлоры как причины воспаления или дискомфорта.
3. Выявление этиологически значимых возбудителей уретрита/простатита: Количественное определение УПМ (Staph, Strep, Enterobact, Enteroc, Gardnerella, Ureaplasma, Mycoplasma hominis, Candida) и абсолютных патогенов (гонококк, трихомонада, хламидия, M. genitalium).
4. Дифференциальная диагностика причин урогенитальных симптомов: Зуд, жжение, дискомфорт в уретре, выделения, дизурия.
5. Обследование при мужском бесплодии: Выявление возможной микробной составляющей.
6. Контроль лечения: Оценка эффективности терапии дисбиоза или ИППП (исчезновение/снижение патогенов, восстановление нормофлоры).
7. Дообследование при неудовлетворительных результатах рутинных анализов (микроскопия, посев): Особенно при стертой картине или хроническом процессе.

7. Что значат полученные результаты
   Интерпретацию проводит врач, учитывая клинику и другие данные. Основные параметры:

• Общая бактериальная масса (ОБМ):
  • Низкая (< 10^4 ГЭ/образец): Материал неадекватен или состояние тяжелого дисбиоза/асептического воспаления. Возможно, нужен перезабор.
  • Нормальная (10^4 – 10^8 ГЭ/образец): Достаточное количество материала для анализа.
  • Высокая (> 10^8 ГЭ/образец): Выраженная микробная обсемененность, характерна для острого воспаления.
• Lactobacillus spp. (Лактобациллы): Ключевой компонент нормофлоры.
  • ОК > 1% от ОБМ: Нормальное состояние.
  • ОК < 1% от ОБМ: Дефицит нормофлоры, фактор риска дисбиоза.
• Условно-патогенные микроорганизмы (УПМ): (Staph, Strep, Enterobact, Enteroc, Corynebact, Gardnerella, Ureaplasma spp., M. hominis, Candida spp.)
  • Количественная оценка (КО): Указывается в Геномных Эквивалентах (ГЭ) на образец. Важен абсолютный уровень:
    • < 10^4 ГЭ/образец: Нормальное носительство.
    • ≥ 10^4 – < 10^5 ГЭ/образец: Умеренное количество, клиническая значимость сомнительна.
    • ≥ 10^5 ГЭ/образец: Высокое количество, может быть этиологически значимо при наличии симптомов.
  • Относительная концентрация (ОК): % от ОБМ.
    • ОК > 10% для некоторых УПМ (особенно Gardnerella, Enterobacteriaceae) часто указывает на их ведущую роль в дисбиозе.
• Абсолютные патогены (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium):
  • Обнаружено/Не обнаружено: Качественный результат. «Обнаружено» указывает на инфицирование данным возбудителем, требующее специфического лечения.
• Дисбиотический индекс (ДИ): Рассчитывается автоматически на основе соотношения лактобацилл и УПМ.
  • ДИ от -2 до +2: Нормальное состояние микробиоты (нормоценоз).
  • ДИ < -2: Выраженный дефицит лактобацилл и/или умеренный избыток УПМ (умеренный дисбиоз).
  • ДИ > +2: Значительный избыток УПМ (выраженный дисбиоз).

8. Факторы, влияющие на результат

• Нарушение подготовки: Прием антибиотиков/антимикотиков (ложноотрицательные результаты), использование антисептиков (ложноотрицательные), половой акт (контаминация, ложноположительные), неправильный забор мочи (не первая порция, долгое воздержание от мочеиспускания).
• Неадекватный материал: Низкая ОБМ требует перезабора.
• Транспортировка и хранение: Нарушение сроков или температурного режима ведет к деградации ДНК и ложноотрицательным результатам. Замораживание мочи разрушает клетки.
• Контаминация: Нестерильный контейнер, неправильная техника забора.
• Вариабельность микробиоты: Состав может колебаться в течение дня, после мочеиспускания, полового акта. Утренняя моча наиболее информативна.
• Инструментальные вмешательства: Недавние манипуляции на уретре искажают картину.
• Методологические ограничения ПЦР: Обнаруживает ДНК, а не только живые микроорганизмы. Не заменяет посев на чувствительность к антибиотикам. Может дать ложноотрицательный результат при очень низкой концентрации или наличии ингибиторов ПЦР в образце. Ложноположительный – крайне редок при правильной организации лабораторного процесса.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (Андрофлор-Скрин):

1. Домрачева Е.В., Гусакова Д.А., Зоркин С.Н. и др. Применение тест-системы «Андрофлор» для оценки микробиоценоза уретры у мужчин. // Вестник урологии. – 2016. – Т. 4, №2. – С. 42–53. (Ключевая публикация разработчиков)
2. Европейское руководство по урологическим инфекциям (EAU Guidelines on Urological Infections). – 2023. (Разделы по диагностике уретрита, простатита, использованию молекулярных методов).
3. Hou D, Zhou X, Zhong X et al. Microbiota of the seminal fluid from healthy and infertile men. Fertil Steril. 2013;100(5):1261-1269. (О роли микробиоты в мужском бесплодии).
4. Mändar R, Punab M, Borovkova N et al. Complementary seminovaginal microbiome in couples. Res Microbiol. 2015;166(5):440-447. (О взаимосвязи микрофлоры партнеров).

Budding A.E., Hoogewerf M., Vandenbroucke-Grauls C.M.J.E. et al. Automated Broad-Range Molecular Detection of Bacteria in Clinical Samples. J Clin Microbiol. 2016;54(4):934-943. (О принципах ПЦР-диагностики микробиоты).

1. Краткая История
   Открытие роли вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки принадлежит Харальду цур Хаузену (Нобелевская премия 2008 г.). С развитием молекулярной биологии стало ясно, что существует множество типов ВПЧ с разной онкогенной опасностью. В 1980-90-х годах были разработаны первые методы ПЦР для детекции ВПЧ. Понимание, что персистенция высокоонкогенных типов ВПЧ (ВКР ВПЧ)– ключевой фактор риска рака, привело к созданию тестов, способных не только обнаруживать ВПЧ, но и определять конкретные генотипы. Тест «ВПЧ КВАНТ-15»(разработка «ДНК-Технология», Россия) – это современный мультиплексный ПЦР-тест в реальном времени, позволяющий количественно определить вирусную нагрузку и генотипировать 15 наиболее клинически значимых типов ВПЧ: 12 высокоонкогенных (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) и 3 низкоонкогенных (6,11), вызывающих аногенитальные кондиломы. Это позволяет проводить стратификацию риска и персонализировать наблюдение.
2. Материал, используемый для исследования

• Основной материал: Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала (у женщин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из уретры (у мужчин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из вульвы/вагины/перианальной области (при поражениях) ИЛИ биоптат/мазок-отпечаток с кондиломы/папилломы.
• Тип контейнера: Специальная стерильная щеточка (цитощетка типа Цервикс-Браш или аналогичная) в жидкой транспортной среде (специальный раствор для сохранения клеток и ДНК/РНК, например, типа ThinPrep® или аналоги). Сухие зонды или мазки на стекле не подходят!
• Важно: Использовать только специализированные наборы для забора, предоставляемые лабораторией.

3. Как подготовиться к анализу

• Для женщин:
  • Забор проводится не во время менструации (оптимально на 10-20 день цикла).
  • За 48 часов: Исключить половые контакты, вагинальные свечи, кремы, тампоны, спринцевания, трансвагинальное УЗИ, кольпоскопию.
  • За 24 часа: Не проводить гигиену с антисептиками.
• Для мужчин/женщин (уретра, другие локализации):
  • За 48 часов: Исключить половые контакты.
  • За 1.5-2 часа до соскоба из уретры: Не мочиться.
• Общее:
  • Не применять местные антисептики или антибиотики в области забора за 48-72 часа.
  • Не принимать системные противовирусные препараты (особенно против ВПЧ) без согласования с врачом (могут снизить вирусную нагрузку).
  • После кольпоскопии с уксусной пробой или пробой Шиллера должно пройти 48-72 часа.
  • После лечения (деструкция, конизация) забор проводят не ранее, чем через 4-6 недель для оценки эффективности.
• Транспортировка: Доставить в лабораторию в течение 1-3 дней при +2…+8°С (в холодильнике). Уточнить стабильность конкретной транспортной среды.

4. Описание метода и типов ВПЧ

• Метод: Мультиплексная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с генотипированием. Метод основан на:
  1. Экстракции ДНК из образца.
  2. Одновременной амплификации (умножении) специфичных участков ДНК каждого из 15 типов ВПЧ + контроль взятия материала (КВМ) в одной пробирке с разными флуоресцентными метками.
  3. Детекции накопления флуоресцентного сигнала в «реальном времени» на каждом цикле ПЦР. Порог цикла (Ct) обратно пропорционален количеству вирусной ДНК.
  4. Генотипирование: По специфичности флуоресцентного сигнала и/или температуре плавления продуктов амплификации (метод High Load) определяется, какой именно тип ВПЧ присутствует.
  5. Количественное определение: По значению Ct для каждого типа рассчитывается вирусная нагрузка в Геномных Эквивалентах (ГЭ) на 10^5 клеток эпителия (по КВМ).
• Определяемые типы ВПЧ и их значение:

• • ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР ВПЧ): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Вызывают дисплазию (CIN) и рак шейки матки, анальный рак, рак вульвы/вагины, рак ротоглотки, рак полового члена. Типы 16 и 18 ответственны за ~70% всех РШМ.
  • ВПЧ низкого канцерогенного риска (НКР ВПЧ): 6, 11. Вызывают аногенитальные кондиломы и папилломы, респираторный папилломатоз. Практически не вызывают рак.

5. Диагностика заболеваний
   «ВПЧ КВАНТ-15» используется для:

• Скрининга рака шейки матки (РШМ): В сочетании с цитологией (ПАП-тест) у женщин старше 25-30 лет (реже у мужчин для скрининга анального рака в группах риска).
• Триажирования аномальных результатов цитологии (ПАП-теста): При ASC-US (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения) для определения тактики (кольпоскопия или наблюдение).
• Оценки риска развития дисплазии/рака: Выявление и количественная оценка ВКР ВПЧ, особенно 16/18 типа.
• Контроля после лечения CIN (дисплазии) или РШМ: Оценка элиминации ВПЧ как маркера успешности лечения и риска рецидива.
• Диагностики генитальных кондилом: Выявление типов 6/11 как основной причины.
• Обследования половых партнеров пациентов с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями.
• Оценки эффективности вакцинации против ВПЧ: Мониторинг заражения вакцинными и невакцинными типами.

6. Цель исследования
   Основные цели назначения:

1. Стратификация риска развития РШМ: Обнаружение ВКР ВПЧ, особенно 16/18 типа, и их вирусной нагрузки – ключевой фактор риска персистенции и прогрессии.
2. Генотипирование ВПЧ: Определение конкретных типов вируса для:
   • Оценки индивидуального онкориска (типы 16/18 несут высочайший риск).
   • Решения о необходимости кольпоскопии (особенно при ASC-US, если выявлен ВКР ВПЧ).
   • Дифференциации персистирующей инфекции от нового заражения.
   • Оценки охвата вакцинации (выявление вакцинных типов 6,11,16,18).
3. Количественное определение вирусной нагрузки: Высокая нагрузка ВКР ВПЧ ассоциирована с большим риском персистенции и наличием CIN. Динамическое наблюдение за нагрузкой помогает оценить эффективность иммунного ответа или лечения.
4. Диагностика причины кондилом: Обнаружение типов 6/11.
5. Контроль после лечения: Подтверждение элиминации ВПЧ (отсутствие ДНК) или выявление персистенции/реинфекции.

7. Что значат полученные результаты

• Контроль взятия материала (КВМ): Должен быть положительным (≥ 10^4 клеток). Если КВМ < 10^4 клеток, результат недействителен (неадекватный забор), нужен перезабор.
• ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68):
  • Не обнаружено: ДНК этих типов ВПЧ в образце нет. Риск развития CIN/РШМ, связанный с этими типами, минимален на момент исследования.
  • Обнаружено (с указанием типа и вирусной нагрузки):
    • Тип: Конкретный выявленный генотип (например, ВПЧ 16, ВПЧ 31). Наличие ВПЧ 16 или 18 требует особого внимания и часто прямого направления на кольпоскопию даже при нормальной цитологии.
    • Вирусная нагрузка: Указывается в ГЭ/10^5 клеток (например, 5.2 x 10^5 ГЭ/10^5 клеток). Высокая нагрузка (> 10^5 ГЭ/10^5 клеток) особенно для типов 16/18, ассоциирована с повышенным риском наличия CIN2+ (умеренной дисплазии или хуже). Низкая нагрузка (< 10^3 ГЭ/10^5 клеток) чаще указывает на транзиторную инфекцию. Однако любое обнаружение ВКР ВПЧ требует внимания врача и динамики.
• ВПЧ низкого риска (6, 11):
  • Не обнаружено: ДНК этих типов ВПЧ в образце нет. Кондиломы, вероятно, вызваны другими причинами или другими типами ВПЧ (не входящими в панель).
  • Обнаружено (с указанием типа и нагрузки): Подтверждает, что кондиломы (если есть) или носительство вызвано этими типами. Вирусная нагрузка менее значима для прогноза онкозаболеваний, но может коррелировать с активностью кондилом.
• Важно:
  • Положительный результат не означает рак или даже дисплазию. Он означает инфицирование и повышенный риск.
  • Отрицательный результат не исключает полностью ВПЧ-инфекцию (возможно заражение типами не из панели КВАНТ-15 или очень низкая нагрузка).
  • Решение о дальнейшем обследовании (кольпоскопия) или тактике ведения принимает врач на основании комбинации: наличия/отсутствия ВКР ВПЧ, конкретных генотипов (особенно 16/18), вирусной нагрузки, результатов цитологии, возраста женщины и анамнеза.

8. Факторы, влияющие на результат

• Нарушение техники забора материала: Неадекватный соскоб (мало клеток → ложноотрицательный КВМ), контаминация.
• Нарушение подготовки: Половой акт, спринцевания, местные препараты (могут снизить нагрузку или дать ложноотрицательный результат).
• Транспортировка и хранение: Нарушение температурного режима или сроков → деградация ДНК → ложноотрицательный результат.
• Стадия инфекции: В латентной фазе или при очень раннем заражении нагрузка может быть ниже порога детекции.
• Локализация забора: При поражениях вульвы/перианальной области забор из цервикального канала может не выявить вирус.
• Ингибиторы ПЦР: Присутствие в образце веществ (гемоглобин, слизь, цервикальная слизь при неправильной подготовке), подавляющих реакцию ПЦР → ложноотрицательный или заниженный результат.
• Недавнее лечение: Деструкция очагов, противовирусная терапия → снижение нагрузки.
• Методологические ограничения: Тест не определяет онкогенную активность вируса (интеграцию в геном, экспрессию онкобелков E6/E7). Не выявляет другие типы ВПЧ, кроме 15 указанных.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (ВПЧ КВАНТ-15):

1. de Sanjose S, Quint W.G.V, Alemany L et al. Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study. Lancet Oncol. 2010;11(11):1048-1056. (О распределении онкогенных типов ВПЧ при РШМ).
2. Schiffman M, Castle P.E, Jeronimo J et al. Human papillomavirus and cervical cancer. Lancet. 2007;370(9590):890-907. (Фундаментальный обзор).
3. Perkins R.B, Guido R.S, Castle P.E et al. 2019 ASCCP Risk-Based Management Consensus Guidelines for Abnormal Cervical Cancer Screening Tests and Cancer Precursors. J Low Genit Tract Dis. 2020;24(2):102-131. (Роль ВПЧ-тестирования и генотипирования в скрининге).
4. Arbyn M, Snijders P.J.F, Meijer C.J.L.M et al. Which high-risk HPV assays fulfil criteria for use in primary cervical cancer screening? Clin Microbiol Infect. 2015;21(9):817-826. (О валидации ВПЧ-тестов для скрининга).

ДНК-Технология. Инструкция по применению набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека (Human papillomavirus, HPV) 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 типов методом ПЦР в режиме реального времени (ВПЧ КВАНТ-15). (Официальная инструкция тест-системы)

1. Краткая История
   Понимание ключевой роли ВПЧ 16 и 18 типов в развитии рака шейки матки (~70% случаев) и ВПЧ 6 и 11 типов в развитии аногенитальных кондилом (~90% случаев) привело к разработке профилактических вакцин. Первая квадривалентная вакцина Гардасил®, защищающая именно от типов 6,11,16,18, была зарегистрирована в 2006 году. Это создало потребность в специфических тестах для:

1. Оценки распространенности именно этих типов.
2. Мониторинга эффективности вакцинации.
3. Стратификации риска у женщин (особенно выявление 16/18).
   Тест «ВПЧ КВАНТ-4» (разработка «ДНК-Технология», Россия) – это узконаправленный мультиплексный ПЦР-тест в реальном времени, позволяющий количественно определить вирусную нагрузку и генотипировать только 4 типа ВПЧ: высокоонкогенные 16 и 18 и низкоонкогенные 6 и 11. Он фокусируется на наиболее клинически значимых и вакцинных типах.

2. Материал, используемый для исследования

• Основной материал: Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала (у женщин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из уретры (у мужчин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из вульвы/вагины/перианальной области ИЛИ биоптат/мазок-отпечаток с кондиломы/папилломы.
• Тип контейнера: Специальная стерильная щеточка (цитощетка типа Цервикс-Браш или аналогичная) в жидкой транспортной среде (ThinPrep® или аналоги). Сухие зонды не годятся.
• Важно: Использовать только специализированные наборы для забора от лаборатории.

3. Как подготовиться к анализу

• Аналогично подготовке к «ВПЧ КВАНТ-15» (см. статью 2):
  • Женщины: Не во время менструации. За 48 часов: исключить секс, вагинальные препараты, тампоны, спринцевания, УЗИ, кольпоскопию. За 24 часа: не использовать антисептики.
  • Мужчины/Женщины (уретра): За 48 часов исключить секс. За 1.5-2 часа не мочиться перед соскобом из уретры.
  • Общее: Не применять местные антисептики/антибиотики за 48-72 часа. Отмена системных противовирусных – по согласованию. После кольпоскопии – 48-72 часа. После лечения – минимум 4-6 недель.
• Транспортировка: +2…+8°С, в течение 1-3 дней.

4. Описание метода и типов ВПЧ

• Метод: Мультиплексная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с генотипированием. Принцип аналогичен «КВАНТ-15», но нацелен только на 4 типа:
  1. Экстракция ДНК.
  2. Одновременная амплификация специфичных участков ДНК ВПЧ 6, 11, 16, 18 + КВМ в одной пробирке с разными флуоресцентными метками.
  3. Детекция сигнала в реальном времени. Расчет Ct.
  4. Генотипирование: Определение конкретного типа (6,11,16,18) по специфичности сигнала.
  5. Количественное определение: Расчет вирусной нагрузки (ГЭ/10^5 клеток) для каждого обнаруженного типа.
• Определяемые типы ВПЧ:

• • ВПЧ 16, 18: Высокоонкогенные типы (ВКР ВПЧ). Основные виновники РШМ, рака ануса, вульвы/вагины, полового члена, ротоглотки.
  • ВПЧ 6, 11: Низкоонкогенные типы (НКР ВПЧ). Основная причина генитальных и респираторных папиллом/кондилом.

5. Диагностика заболеваний
   «ВПЧ КВАНТ-4» используется для:

• Скрининга РШМ (фокус на 16/18): Особенно в алгоритмах, где обнаружение именно ВПЧ 16/18 является прямым показанием к кольпоскопии, независимо от цитологии.
• Триажирования аномальной цитологии (ASC-US): Выявление ВКР ВПЧ 16/18 для принятия решения о кольпоскопии.
• Стратификации риска: Женщины с ВПЧ 16/18 имеют наивысший риск развития CIN3+ (тяжелой дисплазии/рака in situ).
• Диагностики причины аногенитальных кондилом: Выявление типов 6/11.
• Мониторинга эффективности вакцинации против ВПЧ (квадривалентной Гардасил/Церварикс): Оценка заражения вакцинными типами (6,11,16,18) у привитых.
• Контроля после лечения CIN/кондилом: Оценка элиминации специфических вакцинных/онкогенных типов.

6. Цель исследования
   Основные цели назначения:

1. Выявление и генотипирование ВПЧ 16 и 18 типов: Определение женщин с наивысшим риском развития РШМ для приоритетного направления на кольпоскопию.
2. Выявление и генотипирование ВПЧ 6 и 11 типов: Подтверждение основной причины аногенитальных кондилом.
3. Количественная оценка вирусной нагрузки ВПЧ 16/18: Высокая нагрузка ассоциирована с большей вероятностью наличия CIN2+ и персистенции.
4. Оценка эффективности квадривалентной вакцинации: Мониторинг инфицирования типами 6,11,16,18 у привитых лиц.
5. Контроль элиминации специфических типов ВПЧ после лечения: Подтверждение успешности лечения дисплазии (элиминация 16/18) или кондилом (элиминация 6/11).

7. Что значат полученные результаты

• Контроль взятия материала (КВМ): Должен быть положительным (≥ 10^4 клеток). Неадекватный забор → перезабор.
• ВПЧ 16 и/или 18:
  • Не обнаружено: ДНК ВПЧ 16 и 18 типов в образце нет. Риск РШМ, связанный с этими типами, минимален на момент исследования. Не исключает инфицирование другими ВКР ВПЧ.
  • Обнаружено (с указанием типа и вирусной нагрузки):
    • Тип: Указывается конкретно ВПЧ 16, ВПЧ 18 или оба.
    • Вирусная нагрузка: ГЭ/10^5 клеток. Любое обнаружение ВПЧ 16 или 18 является показанием для углубленного обследования (кольпоскопия) у женщин, особенно старше 30 лет, независимо от результата цитологии (по современным рекомендациям ASCCP). Высокая нагрузка усиливает этот риск.
• ВПЧ 6 и/или 11:
  • Не обнаружено: ДНК ВПЧ 6 и 11 типов в образце нет. Кондиломы, вероятно, вызваны другими типами ВПЧ (если есть).
  • Обнаружено (с указанием типа и нагрузки): Подтверждает, что кондиломы (если есть) или носительство вызвано именно этими типами. Вирусная нагрузка может коррелировать с клинической картиной кондилом.
• Важно:
  • Этот тест не выявляет другие типы ВПЧ (31,33,45,51 и т.д.). Отрицательный результат на 16/18 не исключает инфицирование другими ВКР ВПЧ и связанный с ними риск.
  • Результат интерпретируется врачом в комплексе с анамнезом, осмотром, цитологией, данными о вакцинации.

8. Факторы, влияющие на результат
   Факторы аналогичны «ВПЧ КВАНТ-15» (см. статью 2):

• Нарушение забора/подготовки/транспортировки.
• Неадекватный материал (низкий КВМ).
• Стадия инфекции (низкая нагрузка).
• Локализация забора.
• Наличие ингибиторов ПЦР.
• Недавнее лечение.
• Методологические ограничения (только 4 типа).

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (ВПЧ КВАНТ-4):

1. Wright T.C., Stoler M.H., Behrens C.M. et al. Primary cervical cancer screening with human papillomavirus: end of study results from the ATHENA study using HPV as the first-line screening test. Gynecol Oncol. 2015;136(2):189-197. (ATHENA — доказательство эффективности стратегии с генотипированием 16/18).
2. Castle P.E., Stoler M.H., Wright T.C. et al. Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older: a subanalysis of the ATHENA study. Lancet Oncol. 2011;12(9):880-890. (Роль генотипирования 16/18 в скрининге).
3. Schiffman M, Kinney W.K, Cheung L.C et al. Relative Performance of HPV and Cytology Components of Cotesting in Cervical Screening. J Natl Cancer Inst. 2018;110(5):501-508. (Сравнение стратегий).
4. Garland S.M, Steben M, Sings H.L et al. Natural history of genital warts: analysis of the placebo arm of 2 randomized phase III trials of a quadrivalent HPV (types 6, 11, 16, and 18) vaccine. J Infect Dis. 2009;199(6):805-814. (Роль 6/11 в кондиломах).
5. ДНК-Технология. Инструкция по применению набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека (Human papillomavirus, HPV) 6, 11, 16, 18 типов методом ПЦР в режиме реального времени (ВПЧ КВАНТ-4). (Официальная инструкция).

1. Краткая История
   Качественное ПЦР-тестирование на ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР ВПЧ) стало революцией в скрининге рака шейки матки (РШМ). После доказательства Харальдом цур Хаузеном роли ВПЧ в РШМ, разработка ПЦР Кари Мюллисом (Нобелевская премия 1993 г.) открыла путь к высокочувствительной детекции вируса. Первые качественные ПЦР-тесты на ВКР ВПЧ появились в 1990-х годах (например, Hybrid Capture 2 — HC2). Они позволяли обнаружить группу 13-14 ВКР типов, но без определения конкретного генотипа и вирусной нагрузки, лишь давая ответ «обнаружено/не обнаружено». Несмотря на появление более продвинутых тестов (генотипирование, количественные), качественное определение группы ВКР ВПЧостается широко используемым, экономически эффективным методом первичного скрининга или триажирования, подтверждая наличие любогоиз опасных типов вируса.
2. Материал, используемый для исследования

• Основной материал: Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала (у женщин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из уретры (у мужчин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из вульвы/вагины/перианальной области ИЛИ биоптат/мазок-отпечаток с очага.
• Тип контейнера: Специальная стерильная щеточка (цитощетка) в жидкой транспортной среде (ThinPrep® или аналоги) ИЛИ сухая стерильная пробирка типа «Эппендорф» (только для соскобов/биоптатов при использовании методик, допускающих сухой материал, что бывает реже). Предпочтительна жидкая среда.
• Важно: Использовать наборы для забора, соответствующие требованиям лаборатории и применяемому методу ПЦР.

3. Как подготовиться к анализу
   Подготовка идентична подготовке к «ВПЧ КВАНТ-15» и «КВАНТ-4» (см. статьи 2 и 3):

• Женщины: Не во время менструации. За 48 часов: исключить секс, вагинальные препараты, тампоны, спринцевания, УЗИ, кольпоскопию. За 24 часа: не использовать антисептики.
• Мужчины/Женщины (уретра): За 48 часов исключить секс. За 1.5-2 часа не мочиться перед соскобом из уретры.
• Общее: Не применять местные антисептики/антибиотики за 48-72 часа. Отмена системных противовирусных – по согласованию. После кольпоскопии – 48-72 часа. После лечения – минимум 4-6 недель.
• Транспортировка: +2…+8°С, в течение времени, указанного лабораторией (1-3 дня для жидкой среды).

4. Описание метода

• Метод: Качественная Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР). Суть метода:
  1. Экстракция ДНК: Выделение всей ДНК из образца.
  2. Амплификация: Многократное копирование (умножение) специфического участка ДНК, характерного для группы ВКР ВПЧ. Используются:
     • Консенсусные праймеры: Распознают консервативные участки генома, общие для многих ВКР типов (часто мишенью служат гены L1 или E1). Не различают конкретные типы!
     • Типоспецифичные праймеры в мультиплексном формате: Набор праймеров, каждый из которых специфичен к своему типу ВКР ВПЧ (например, 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68). Позволяет определить, что какой-то из этих типов присутствует, но без идентификации конкретного (ответ все равно «обнаружено» для группы). Реже используется.
  3. Детекция результата:
     • Электрофорез в агарозном геле: Визуализация полосы ДНК ожидаемого размера под УФ светом после окрашивания. Субъективный метод.
     • Флуоресцентная детекция в конце реакции (end-point PCR): Использование интеркалирующих красителей (SYBR Green) или флуоресцентных зондов (TaqMan), дающих сигнал при накоплении продукта. Более объективно.
  4. Контроли: Обязательно используются контроли экстракции (КЭ) и амплификации (КВМ — контроль взятия материала, КПЦР — контроль ПЦР-реакции).
• Определяемые типы: Зависит от тест-системы. Обычно включает 12-14 ВКР типов: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Некоторые системы включают 66. Конкретный список уточняется в лаборатории.

5. Диагностика заболеваний
   Качественный тест на ВКР ВПЧ применяется для:

• Первичного скрининга РШМ: У женщин старше 25-30 лет, часто в сочетании с цитологией (co-testing) или как самостоятельный первичный тест (HPV primary screening).
• Триажирования аномальных результатов цитологии (ASC-US): Определение необходимости кольпоскопии. Если ВКР ВПЧ обнаружен → кольпоскопия.
• Контроля после лечения CIN (дисплазии): Оценка элиминации ВКР ВПЧ как маркера успешности лечения (цель — «не обнаружено»).
• Обследования женщин с неясными гинекологическими симптомами.
• Обследования половых партнеров пациентов с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями.
• Скрининга анального рака в группах высокого риска (МСМ, ВИЧ+).

6. Цель исследования
   Основные цели назначения:

1. Скрининг на наличие инфекции ВКР ВПЧ: Ответ на вопрос: инфицирована ли пациентка каким-либо из высокоонкогенных типов ВПЧ?
2. Определение показаний к кольпоскопии: При аномальной цитологии (особенно ASC-US) или как часть первичного скрининга (если тест положительный).
3. Оценка риска развития РШМ: Сам факт обнаружения ВКР ВПЧ повышает риск по сравнению с отрицательным результатом.
4. Контроль излеченности после терапии по поводу CIN: Подтверждение эрадикации ВКР ВПЧ (отрицательный результат — хороший прогностический признак).

7. Что значат полученные результаты

• Контроль взятия материала (КВМ) / Контроль экстракции (КЭ): Должны быть положительными. Неадекватный материал → результат недействителен.
• Контроль ПЦР (КПЦР): Должен быть положительным, подтверждая адекватность реакционной смеси.
• ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска:
  • Не обнаружено: ДНК ВКР ВПЧ (типов, определяемых данной тест-системой) в образце не выявлено. Риск наличия CIN2+ в данный момент очень низок. Не исключает инфицирование в прошлом или заражение в будущем.
  • Обнаружено: В образце выявлена ДНК одного или нескольких типов ВКР ВПЧ из группы, определяемой тест-системой. Это означает:
    • Наличие инфекции, вызванной опасными типами ВПЧ.
    • Повышенный риск развития дисплазии (CIN) и рака шейки матки (а также других аногенитальных раков).
    • Необходимость дальнейшего обследования или усиления наблюдения в зависимости от клинического контекста (возраст, цитология, анамнез):
      • При скрининге у женщин 25-65 лет: Если результат первичного скрининга или ко-тестинга → направление на цитологию (если не делалась) или кольпоскопию (по алгоритмам, например, ASCCP).
      • При ASC-US цитологии → прямое направление на кольпоскопию.
      • После лечения CIN → требует более частого контроля.
• Важно:
  • Положительный результат НЕ означает наличие рака или дисплазии. У большинства женщин инфекция транзиторная и разрешается самостоятельно.
  • Положительный результат НЕ указывает на конкретный тип ВПЧ (16, 18 или другой) и на вирусную нагрузку.
  • Отрицательный результат НЕ исключает полностью риск РШМ (редкие ВКР типы, не входящие в панель; ложноотрицательный результат; рак, не ассоциированный с ВПЧ).
  • Интерпретация и дальнейшие шаги обязательно определяются врачом на основании комплексной оценки.

8. Факторы, влияющие на результат

• Нарушение преаналитики: Неправильный забор, подготовка, транспортировка, хранение → ложноотрицательный результат.
• Неадекватный материал: Мало клеток (низкий КВМ/КЭ).
• Ингибиторы ПЦР: Присутствие в образце веществ, блокирующих реакцию → ложноотрицательный результат.
• Стадия инфекции: Очень ранняя или латентная фаза с низким числом копий ДНК → ложноотрицательный.
• Типы ВПЧ: Тест не выявляет типы, не входящие в его панель. Некоторые системы могут не детектировать тип 68 или 66.
• Метод детекции: Электрофорез менее чувствителен и специфичен, чем флуоресцентная детекция.
• Недавнее лечение: Может привести к ложноотрицательному результату.
• Ложноположительный результат: Крайне редок при соблюдении всех процедур, возможен при контаминации в лаборатории.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (ВПЧ ВКР качественный):

1. Arbyn M, Ronco G, Anttila A et al. Evidence regarding human papillomavirus testing in secondary prevention of cervical cancer. Vaccine. 2012;30 Suppl 5:F88-99. (Обзор доказательной базы ВПЧ-тестирования).
2. Saslow D, Solomon D, Lawson H.W et al. American Cancer Society, American Society for Colposcopy and Cervical Pathology, and American Society for Clinical Pathology screening guidelines for the prevention and early detection of cervical cancer. CA Cancer J Clin. 2012;62(3):147-172. (Рекомендации по скринингу, включая ВПЧ-тестирование).
3. Meijer C.J., Berkhof J., Castle P.E. et al. Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 2009;124(3):516-520. (Требования к ВПЧ-тестам для скрининга).
4. Cuzick J, Clavel C, Petry K.U et al. Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening. Int J Cancer. 2006;119(5):1095-1101. (Сравнение исследований).
5. Koliopoulos G, Nyaga V.N, Santesso N et al. Cytology versus HPV testing for cervical cancer screening in the general population. Cochrane Database Syst Rev. 2017;8(8):CD008587. (Кохрейновский обзор).

1. Краткая История
   Качественное обнаружение ВКР ВПЧ стало прорывом в скрининге РШМ. Однако стало ясно, что вирусная нагрузка(количество копий ДНК вируса на клетку) является важным независимым фактором риска персистенции инфекции и прогрессирования в дисплазию (CIN) и рак. Развитие ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)в конце 1990-х — начале 2000-х годов позволило не только детектировать ДНК ВКР ВПЧ, но и количественно определять ее количество в образце. Первые количественные тесты часто определяли общую нагрузку группы ВКР типов. Современные тесты, такие как количественные версии «ВПЧ КВАНТ», позволяют определять как общую нагрузку ВКР ВПЧ, так и нагрузку отдельных типов (особенно 16 и 18). Это дало мощный инструмент для стратификации риска и индивидуального подхода к ведению пациентов.
2. Материал, используемый для исследования

• Основной материал: Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала (у женщин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из уретры (у мужчин) ИЛИ соскоб эпителиальных клеток из вульвы/вагины/перианальной области ИЛИ биоптат/мазок-отпечаток с очага.
• Тип контейнера: Специальная стерильная щеточка (цитощетка) в жидкой транспортной среде (ThinPrep® или аналоги). Обязательно! Для корректного количественного определения необходим учет количества клеток эпителия.
• Важно: Использовать специализированные наборы для забора, обеспечивающие сохранность клеток и ДНК.

3. Как подготовиться к анализу
   Подготовка идентичнаподготовке к качественному тесту и тестам «КВАНТ» (см. статьи 2-4):

• Женщины: Не во время менструации. За 48 часов: исключить секс, вагинальные препараты, тампоны, спринцевания, УЗИ, кольпоскопию. За 24 часа: не использовать антисептики.
• Мужчины/Женщины (уретра): За 48 часов исключить секс. За 1.5-2 часа не мочиться перед соскобом из уретры.
• Общее: Не применять местные антисептики/антибиотики за 48-72 часа. Отмена системных противовирусных – по согласованию. После кольпоскопии – 48-72 часа. После лечения – минимум 4-6 недель.
• Транспортировка: +2…+8°С, в течение 1-3 дней. Нарушение условий критично для количественного результата.

4. Описание метода

• Метод: Количественная Полимеразная Цепная Реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Принцип:
  1. Экстракция ДНК: Выделение ДНК из образца.
  2. Амплификация в реальном времени: Копирование специфического участка ДНК ВКР ВПЧ в присутствии флуоресцентного репортера (интеркалирующий краситель SYBR Green или специфический флуоресцентный зонд — TaqMan, Hybrid Probe). Интенсивность флуоресценции растет пропорционально количеству накопленного продукта ПЦР.
  3. Калибровка: Для каждого цикла амплификации (Ct — пороговый цикл) регистрируется уровень флуоресценции. Чем раньше (ниже значение Ct) появляется значимый сигнал флуоресценции, перекрывающий пороговый уровень, тем больше было целевой ДНК в исходном образце.
  4. Количественное определение:
     • Стандартная кривая: Использование образцов с известной концентрацией ДНК ВПЧ для построения графика зависимости Ct от логарифма концентрации. По этому графику рассчитывается концентрация ДНК в клиническом образце.
     • Относительное количество: Чаще используется в клинических тестах. Нагрузка рассчитывается относительно количества клеток человека в образце (по гену-референсу, например, β-глобин, RNase P — Контроль Взятия Материала, КВМ). Результат выдается в Геномных Эквивалентах (ГЭ) на 10^5 клеток эпителия.
  5. Определение группы/типов: Используются:
     • Консенсусные праймеры/зонды: Определяют общую нагрузку группы ВКР ВПЧ (без дифференциации типов).
     • Типоспецифичные праймеры/зонды: Позволяют определить нагрузку конкретных типов (чаще всего 16 и 18 отдельно, а остальные ВКР типы — суммарно или также отдельно). Конкретная панель зависит от тест-системы (аналогично «КВАНТ-15» или «КВАНТ-4», но с количественным результатом для каждого).

5. Диагностика заболеваний
   Количественный тест на ВКР ВПЧ используется для:

• Скрининга РШМ: Стратификация риска не только по наличию, но и по уровню вирусной нагрузки.
• Триажирования аномальных результатов цитологии (ASC-US): Высокая нагрузка ВКР ВПЧ повышает вероятность CIN.
• Оценки риска персистенции ВПЧ и прогрессирования в CIN/рак: Высокая исходная нагрузка и/или ее увеличение в динамике — неблагоприятные прогностические факторы.
• Мониторинга течения ВПЧ-инфекции: Наблюдение за изменением вирусной нагрузки в динамике (спонтанное снижение/исчезновение — признак транзиторной инфекции; персистенция или рост — признак высокого риска).
• Контроля эффективности лечения CIN (дисплазии): Снижение нагрузки или элиминация вируса — хороший прогностический признак. Персистенция высокой нагрузки — риск рецидива.

6. Цель исследования
   Основные цели назначения:

1. Количественная оценка вирусной нагрузки ВКР ВПЧ: Определение не только факта инфицирования, но и количества вирусной ДНК.
2. Стратификация индивидуального риска развития CIN/РШМ: Высокая нагрузка ВКР ВПЧ (особенно типов 16/18) ассоциирована с повышенным риском наличия и прогрессирования дисплазии.
3. Дифференциация клинически значимой инфекции от транзиторного носительства: Высокая нагрузка чаще указывает на активную инфекцию с риском персистенции.
4. Мониторинг естественного течения ВПЧ-инфекции: Оценка спонтанной элиминации (снижение нагрузки до неопределяемого уровня) или персистенции (стабильно высокая или растущая нагрузка).
5. Оценка эффективности лечения предраковых поражений шейки матки (CIN): Контрольное определение нагрузки после конизации/деструкции для оценки успешности (цель — снижение/исчезновение).

7. Что значат полученные результаты

• Контроль взятия материала (КВМ): Обязательно должен быть ≥ 10^4 клеток (или другого порога, указанного лабораторией). Низкий КВМ делает количественный результат ненадежным.
• ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска:
  • Не обнаружено: ДНК ВКР ВПЧ (типов, определяемых тестом) не выявлено. Вирусная нагрузка = 0 ГЭ/10^5 клеток.
  • Обнаружено (с указанием вирусной нагрузки):
    • Общая нагрузка группы ВКР ВПЧ (если тест не дифференцирует типы) или Нагрузка конкретных типов (16, 18, другие или суммарно).
    • Вирусная нагрузка: Указывается в Логарифмах Геномных Эквивалентов (lg ГЭ) на 10^5 клеток или в абсолютных числах (ГЭ/10^5 клеток). Например:
      • 3.0 x 10^3 ГЭ/10^5 клеток = 3.5 lg ГЭ/10^5 клеток
      • 5.2 x 10^5 ГЭ/10^5 клеток = 5.7 lg ГЭ/10^5 клеток
    • Клиническая интерпретация нагрузки (ориентировочно):
      • < 10^3 ГЭ/10^5 клеток (< 3.0 lg): Низкая нагрузка. Чаще соответствует транзиторной инфекции или носительству. Риск CIN2+ низкий, но не нулевой.
      • 10^3 – 10^5 ГЭ/10^5 клеток (3.0 – 5.0 lg): Умеренная нагрузка. Требует внимания. Риск наличия CIN1-2.
      • 10^5 ГЭ/10^5 клеток (> 5.0 lg): Высокая нагрузка. Ассоциирована с повышенным риском наличия CIN2+ (умеренной/тяжелой дисплазии или рака in situ) и персистенции вируса. Требует обязательного углубленного обследования (кольпоскопия).
    • Особое значение имеет нагрузка ВПЧ 16 и 18 типа: Даже умеренная нагрузка этих типов требует повышенного внимания из-за их исключительно высокой онкогенности. Высокая нагрузка 16/18 — сильный показатель риска CIN2+.
• Важно:
  • Результат всегда интерпретирует врач в комплексе с цитологией, кольпоскопией, анамнезом, возрастом.
  • Высокая нагрузка — не диагноз рака, а индикатор высокого риска, требующий дообследования.
  • Низкая нагрузка не исключает полностью наличие дисплазии (особенно на ранних стадиях).
  • Отрицательный результат (не обнаружено) — хороший прогностический признак низкого текущего риска CIN2+.

8. Факторы, влияющие на результат
   Факторы аналогичны качественному тесту, но критичнее из-за количественной природы:

• Нарушение преаналитики: Неправильный забор (недостаток клеток → занижение КВМ и ложное занижение/завышение нагрузки), подготовка (спринцевания → снижение нагрузки), транспортировка/хранение (деградация ДНК → снижение нагрузки).
• Неадекватный материал: Низкий КВМ делает результат ненадежным.
• Ингибиторы ПЦР: Могут привести к ложноотрицательному результату или занижению нагрузки.
• Стадия инфекции: Нагрузка может колебаться. Пик часто при остром заражении или активной CIN.
• Локализация забора: Неправильная локализация → ложноотрицательный или заниженный результат.
• Метод количественного определения: Точность калибровки и стандартов.
• Естественные колебания: Нагрузка может незначительно меняться между тестами без изменения клинического значения.
• Недавнее лечение: Приводит к снижению нагрузки.

Лаборатория Бойченко гарантирует точность и достоверность результатов благодаря современному оборудованию и высоким стандартам качества.

Список литературы (ВПЧ ВКР количественный):

1. Moberg M, Gustavsson I, Gyllensten U. Real-time PCR-based system for simultaneous quantification of human papillomavirus types associated with high risk of cervical cancer. J Clin Microbiol. 2003;41(7):3221-3228. (Пример ранней количественной системы).
2. Cuschieri K.S, Whitley M.J, Cubie H.A. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence—implications for cervical disease progression and monitoring. J Med Virol. 2004;73(1):65-70. (Связь нагрузки и персистенции).
3. Lorincz A.T, Castle P.E, Sherman M.E et al. Viral load of human papillomavirus and risk of CIN3 or cervical cancer. Lancet. 2002;360(9328):228-229. (Ключевое исследование о связи нагрузки и риска CIN3).
4. Dalstein V, Riethmuller D, Pretet J.L et al. Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a longitudinal French cohort study. Int J Cancer. 2003;106(3):396-403. (Прогностическая роль нагрузки).
5. ДНК-Технология. Инструкция по применению набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека (Human papillomavirus, HPV) высокого канцерогенного риска методом ПЦР в режиме реального времени (ВПЧ ВКР скрин). (Пример инструкции на количественный тест без генотипирования).